Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
обесцвечивающем растворе. Впоследствии было описано еще четыре варианта
этой методи-
Аналитическое ИЭФ
219
f*-----------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------
ки (Vesterberg, Hansen, 1977) с применением различных комбинаций ТХУ,
сульфосалициловой кислоты, хлорной кислоты и мочевины в фиксирующем
растворе. По-видимому, в присутствии мочевины интенсивность окрашивания
возрастает за счет дополнительного разворачивания белковых цепей.
Чувствительность метода достигает примерно 0,2 мкг белка на зону.
4. По Righetti, Drysdale, 1974. Нам удалось разработать метод,
одинаково пригодный для окрашивания как плоских, так и цилиндрических
гелей и сочетающий высокую чувствительность с низким уровнем фона. Гели
погружают на 4-6 ч в 0,0.5%-ный раствор красителя, содержащий 0,1%
сульфата меди в смеси уксусная кислота : этанол : вода (19 : 25 : 65).
Обесцвечивание фона производится в течение 4 ч тем же раствором, но
содержащим только 0,01% СВВ R-250, а в конце просто смесью уксусная
кислота : этанол: вода (10 :10:80). К гелю можно прикасаться только в
перчатках, так как при использовании этой методики прокрашиваются
отпечатки пальцев!
В работе Malik, Berrie, 1972, описана методика окрашивания белков
раствором СВВ R-250, приготовленным с использованием серной кислоты, КОН
и ТХУ. Прокрашивание белков происходит быстро, но сопровождается
развитием заметного фона.
Кумасси ярко-синий (Coomassi Brilliant Blue) G-250. В работе Diezel et
al., 1972, было впервые описано применение СВВ G-250 (диметилпроизводное
красителя СВВ R-250) в виде коллоидного раствора в 12,5%-ной ТХУ. Это
позволило добиться селективного связывания красителя с белковыми зонами,
при котором не происходит проникновения коллоидных частиц в матрицу геля
и, таким образом, не возникает фонового окрашивания. При последующей
обработке геля 5%-ной уксусной кислотой интенсивность окрашивания
белковых зон повышается за счет солюбилизации красителя, связанного с
поверхностным белковым слоем, его диффузии внутрь геля и дополнительного
связывания с внутренними участками соответствующих белковых зон. Было
обнаружено, что в 0,04%-ном СВВ G-250, приготовленном в 3,5%-ном растворе
хлорной кислоты, краситель остается в форме лейкооснования, а -при
связывании с белками переходит в голубую форму (Reisner et al.,
1975). Амфолины при такой обработке в осадок не выпадают, но в геле
появляется оранжево-коричневый фон. Сообщалось, что при дополнительной
промывке 5%-ной уксусной кислотой удается повысить чувствительность в 3
раза (Holbrook, Leaver,
1976), однако фон при этом также становится сильнее. Одна из последних
модификаций метода, описанная в работе Blakesley, Boezi, 1977, является,
по-видимому, идеальным методом окрашивания зон после ИЭФ. К 400 мл 0,2%-
ного раствора краси-
220
Глава 3
теля в НгО добавляют равный объем 2N H2SO4. Через 3 ч удаляют осадок
фильтрованием через ватман ЗММ. К прозрачному фильтрату коричневого цвета
добавляют 90 мл 10 N КОН, после чего раствор приобретает пурпурную
окраску. Добавляют еще 120 мл 100%-ной ТХУ и образовавшийся зеленоватый
раствор используют для окрашивания белков. Краску можно использовать
несколько раз, если pH в растворе не поднимается выше 1. (Оказывается,
что при повторном использовании окрашивание происходит лучше, чем при
употреблении свежей краски, вероятно за счет удаления каких-то примесей,
которые обладают свойством осаждать амфолины нейтрального диапазона;
Righetti, неопубликованные данные), В пластинах геля толщиной 0,7 мм
максимальное окрашивание достигается за 5 ч, хотя полосы становятся
различимыми уже через 15 мин. После перенесения геля в воду интенсивность
окраски заметно возрастает. Этот метод дает прекрасные результаты в
случае ИЭФ пептидов, позволяя фиксировать и регистрировать даже пептиды
из 12-15 аминокислот (Righetti, Chillemi, 1978).
Флуоресцентные красители. Методы анализа, основанные на предварительном
прокрашивании образцов, достигли очень высокого уровня чувствительности с
появлением флуоресцентных красителей, таких, как дансилхлорид (Talbot,
Yaphantis, 1971),
Таблица 3.3. Окрашивание белков после ИЭФ в слое гранулированного геля с
использованием метода бумажных реплик (Radola, 1973а)
Краситель " * 1 Sgfi я - Концентрация красителя, % Объемные
соотношения в смеси метанол : вода : уксусная кислота •Ь з я Si 0
G 5 ? 5 .J3 5 Ь f- * к * _ " w ё 2
Про кие ТХУ раз) окрашива- ние отмывание фона * " Я, о 85
Шум ЕГ яо
Amido Black 10 В 3 0,2 50:50:10 66:33:10 10-20 5-Ю
Bromophenol Blue 0 или I1* 0,1 66:33:10 40:60:10 2-5 3-5
Coomassie Brilliant Blue G-250 3 0,2 50:50:10 33:66:10 3-5
0,5-1
Coomassie Brilliant Blue R-250 3 0,2 50:50:10 33:66:10 3-5
0,5-1
Coomassie Violet R-150 0 или l1* Light Green SF 0 или l1)
0,2
0,2
50:50:10
33:66:10
33:66:10
33:66:10
2
3
Перед окрашиванием удаляли амфолиты-носители вымачиванием в ТХУ (смены
