Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 89

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 83 84 85 86 87 88 < 89 > 90 91 92 93 94 95 .. 171 >> Следующая

3 3.1. Способы окрашивания
Для окрашивания белков после ИЭФ необходимо использовать специально
разработанные методики, поскольку амфолиты-носители образуют
нерастворимые комплексы со многими красителями, применяющимися для
окрашивания белков. Одно из методических решений этой проблемы
заключается в кислотном осаждении сфокусированных белков (например, 10%-
ной ТХУ) % последующем тщательном вымывании кислоторастворимых амфолитов
из геля. После удаления амфолитов белки можно ^Окрашивать традиционными
методами. На сегодняшний день ^разработан ряд прямых методов окрашивания,
позволяющих Опустить трудоемкую процедуру вымывания амфолитов и
основанных на солюбилизации комплексов амфолитов с красителем *ВОД
влиянием органических растворителей и (или) повышенной |температуры
(Righetti et al., 1977). В качестве примеров приведу прописи нескольких
используемых методов окрашивания. ' Быстрый зеленый (Fast Green) FCF
(Riley, Coleman, 1968). Этот краситель применяют для регистрации зон при
содержании белка более 10 мкг (в расчете на 3-мм гель). Гели погружают на
4-8 ч в 0,2%-ный водный раствор красителя (поставляется Fisher
Scientific, NJ, USA), содержащий 10% уксусной кислоты и 25% этанола.
Зоны, окрашенные быстрым зеленым ; FCF, со временем постепенно выцветают.
Светло-зеленый (Light Green) SF. Этот метод был использован в работе
Radola, 1973а, для окрашивания бумажных реплик. После получения реплики с
геля на бумаге ее вымачивают 15 мин в ТХУ. Удаляют ТХУ, погружая бумагу
на несколько ¦'Минут в смесь метанол : вода : уксусная кислота (с
объемным соотношением 33:66:10). После этого окрашивают в течение 15 мин
в такой же смеси, содержащей краситель светло-зеленый SF. в концентрации
0,2%. Фон удаляют промыванием тем же раствором без красителя.
Чувствительность окрашивания в 3-5 раз ниже, чем при использовании СВВ R-
250 или G-250. Благо-¦даря этому метод с успехом использовался для
окрашивания с хорошим разрешением участков реплики, соответствующих очень
высокому содержанию белков (Radola, 1973а). Окрашивание СВВ на этих
участках привело бы к появлению размазанных, плохо разрешенных зон.
Бромфеноловый синий (Bromphenol Blue) (Awdeh, 1969).
4Гель погружают на 3 ч в 2%-ный водный раствор бромфеноло-*ого синего,
содержащий 50% этанола и 5% уксусной кислоты. Обесцвечивают фон 5%-ной
уксусной кислотой в 30%-ном водяном растворе этанола. Обращаться с гелем
при окрашивании
218
Глава 3
следует очень осторожно, избегая соприкосновения его с кожей, тканью,
бумагой и другими сухими поверхностями.
Кумасси ярко-синий (Coomassie Brilliant Blue) R-250. Существует несколько
методик прямого окрашивания белков (после ИЭФ) с помощью этого
популярного чувствительного красителя. Здесь приводятся четыре варианта.
1. По Hayes, Wellner, 1969. После ИЭФ гель фиксируют в растворе,
содержащем 5% ТХУ и 5% сульфосалициловой кислоты, в течение 1 ч. После
этого промывают еще в течение 1 ч тремя литрами воды для удаления избытка
кислоты. Окрашивание проводят в течение 3-4 ч в 0,066%-ном растворе СВВ
R-250, приготовленном в 0,2 М трис-НС1-буфере pH 7,7. Для удаления фона
гель отмывают разбавленным 0,001 М трис-НС1-буфером pH 7,7 в течение 24-
48 ч.
2. По Spencer, King, 1971. Этот метод широко применяется для быстрого
окрашивания сфокусированных белковых зон. Белки связывают краситель из
его слабого (0,01%-ного) водного раствора, содержащего 5% ТХУ, 5%
сульфосалициловой кислоты и 20% метанола. Чувствительность метода ниже,
чем в случае применения других методик окрашивания СВВ, однако удается
получать очень слабый фон. Кроме того, весь процесс проходит от начала до
конца в одном и том же растворе. Обычно оказывается достаточно окрашивать
гель в течение 1 ч. Интенсивность окрашивания зон можно повысить,
увеличив концентрацию красителя до 0,05%, но при этом повышается и
интенсивность фонового окрашивания.
3. По Vesterberg, 1972. В этом методе окрашивание белков СВВ в
присутствии амфолитов достигается за счет обработки геля в течение 15 мин
при 60°С 0,1%-ным водным раствором красителя, содержащим 28% метанола,
11% ТХУ и 3,5% сульфосалициловой кислоты. Обесцвечивание фона проводится
также при 60°С 8%-ной уксусной кислотой в сочетании с 25%-ным этанолом в
воде. Этот метод в большей степени подходит для пластин ПААГ, чем для
цилиндрических гелей. К сожалению, быстро окрашивающиеся зоны часто имеют
тенденцию к постепенному выцветанию. Кроме того, при использовании этой
методики краситель стремится к преципитации на поверхности геля, особенно
в трещинах. Модификация метода была описана в работе Soderholm et al.,
1972. Сразу же после ИЭФ гель погружают в водный раствор, содержащий 2%
сульфосалициловой кислоты, 11% ТХУ и 27% метанола, термостатируемый при
65 °С. Через 20 мин гель дважды отмывают "обесцвечивающим" раствором
(8,5%-ная уксусная кислота - 27%-ный этанол в дистиллированной воде) при
20°С, а затем окрашивают в 0,1%-ном СВВ R-250, приготовленном на
Предыдущая << 1 .. 83 84 85 86 87 88 < 89 > 90 91 92 93 94 95 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed