Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
биологии" (Neuhoff, 1973, р. 49-56). *
Описаны также системы, основанные на применении миниатюрных пластин геля
(Riichel, 1977; Matsudaira, Burgess, 1978; Ogita, Market, 1979; Poehling,
Neuhoff, 1980), главным образом на второй стадии в методе двумерного ИЭФ-
ДДС-Ыа-электро-фореза. Часто для заливки используют камеры стандартного
размера (30X25X0,1 мм) и в них гели полимеризуют на обрезанных до нужного
размера предметных стеклах. В качестве прокладок используют небольшие
полоски, вырезанные из пластиковой пленки толщиной 0,1-0,2 мм. Стеклянные
пластинки по бокам прижимают миниатюрными зажимами, расплавленным
зубоврачебным воском или изоляционной липкой лентой. Если толщина геля
меньше 0,25 мм, то необходимость в герметизации формы снизу отпадает,
поскольку при такой толщине слоя капиллярные силы препятствуют вытеканию
жидкости. При необходимости герметизации снизу нижнюю часть формы
вдавливают в слой пластилина, покрытого сверху парафильмом. Одну из
пластин перед сборкой формы обрабатывают
(метакрилоксипропилтриметоксисиланом) так, чтобы гель оставался
зафиксированным на ней, в том числе и при окрашивании зон. Применение
миниатюрных ультратонких гелей в сочетании с окраской серебром (разд.
3.3.2) дает возможность анализировать субнанограммовые количества белка.
Сообщалось, что при ИЭФ в плоских микрогелях длиной 3 см равновесие в
распределении белковых зон достигается всего лишь за 10 мин. При
уменьшении расстояния между электродами до 1 и 2 см время фокусирования
снижается до 2 и 4 мин соответственно. Время, которое занимают фиксация
белков, окрашивание, удаление фона и сушка геля, составляет всего около 5
мин. Микро-ИЭФ представляется весьма перспективным методом, несмотря на
то что для фотографирования или сканирования микрогелей может
потребоваться специальная аппаратура.
3.2.18. ИЭФ при минусовых температурах
Этот прием представляет собой важный вклад, . внесенный криобиохимией
(Douzou, 1977) в арсенал электрофоретических методов. О первых попытках
изучения "гибридных" тетрамеров гемоглобина с помощью ИЭФ при минусовых
температурах сообщалось в работе Park, 1973. Автору удалось понизить
температуру при фракционировании всего лишь до -5-s- - 10°С.
Опубликованные сравнительно недавно работы Perrella et al., 1978, 1979,
1980, ознаменовали существенный прогресс в этой области. Основные
проблемы, которые пришлось решать, заключа-
216
Глава 3
лись в подборе эффективного метода термостатирования, подходящего состава
геля, который был бы не подвержен стеклованию при температурах ниже -15
°С, и подходящего водно-органического антифриза. При решении этих проблем
использовали модифицированный вариант аппарата для ИЭФ в трубках
(Righetti, Drysdale, 1971, 1973), оснащенного дополнительными змеевиками
охлаждения верхней и нижней электродных камер (см. рис. 3.21). Для
быстрого отвода джоулева тепла использовали узкие стеклянные трубки
(внутренний диаметр 2 мм). Гель представлял собой сополимеры акриламида и
метакрилата или этакрилата и выдерживал температуры до -40-5--50°С без
заметной перестройки матрицы. Что касается водно-органического состава,
то лучшие результаты были получены с использованием смеси ДМСО-вода,
ранее предложенной в работе Righetti et al., 1977. Теоретически ИЭФ можно
проводить при -30 и даже при - 40 °С, однако ввиду крайне высокой
вязкости растворителя и слишком низкой подвижности белков при таких
температурах лучше работать при температурах не ниже - 20 °С.
Еще одна проблема возникает в связи с преципитацией кислых амфолитов
(р1<5), по-видимому в результате агрегации, что вызывает серьезные
искажения градиента pH в зоне преципитации. Таким образом, наиболее
эффективно можно проводить ИЭФ в диапазоне pH выше 5 при температуре не
ниже
- 20 °С в 37%-ном водном растворе ДМСО. Смесь такого состава обладает
пониженной вязкостью и выдерживает температуры до - 30 °С.
Этим методом удавалось регистрировать образование "гибридных"
гемоглобиновых тетрамеров НЬА-HbS из исходных молекул НЬА и HbS (Perrella
et al., 1979), а также серии промежуточных продуктов при окислении НЬСО.
Недавно этим же авторам удалось исследовать профиль градиента pH при
- 20 °С с помощью метода индикаторных красителей, предложенного Douzou,
1977. Вообще говоря, совместное влияние 37 % -ного ДМСО и низкой
температуры (-20 °С) должно повышать все эффективные значения pi
сфокусированных амфолинов (номинальных диапазонов pH 6-8 или 7-9)
примерно на 1 ед. pH по сравнению с ИЭФ при +4°С в водной среде. Тем не
менее, например, для случая карбонильного производного НЬА определенно
установлено, что значение его pi в аналогичной ситуации в такой же
степени сдвигается в щелочную область pH. Крио-ИЭФ, судя по всему,
является весьма эффективным методом изучения таких процессов, как обмен
субъединицами, связывание лигандов или образование фермент-субстратных
комплексов.
Аналитическое ИЭФ
217
3.3. Методы детектирования белков в гелях
