Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
связано с тем, что при таком диаметре еще достигается достаточно
эффективное охлаждение. Сами трубки могут "быть пластиковыми, стеклянными
или кварцевыми. Стеклянные ¦трубки лучше рассеивают тепло, однако в
случае пластиковых трубок полностью отсутствуют поверхностные
осмотические эффекты, обусловленные наличием зарядов на поверхности
стекла. И все же лучше использовать именно стеклянные трубки, Ййоскольку
по сравнению с пластиковыми они характеризуются ¦Значительно более
прочным сцеплением с гелем. При необходимости чистые трубки из
термостойкого стекла можно покрыть 1%-ным раствором реагента Gelamide 250
(поставляется фирмой .polysciences, Warrington, РА), который блокирует
пристеноч-• ные электроэндосмотические токи, часто сопутствующие ИЭФ в
"стеклянных трубках.
Общие указания по выбору состава и условий полимеризации гелей были
приведены в разд. 3.2.8 и 3.2.9, а по выбору электродных растворов - в
разд. 3.2.10. Для заливки гелей ис-яользуют те же приемы, что и при
обычном электрофорезе. •Стеклянные трубки закрывают снизу парафильмом,
пластилином или заглушками типа Vacutainer tops и устанавливают вер-; -
тикально на строго горизонтальную поверхность. После заполнения трубок до
нужной высоты (обычно не доходя 0,5-1 см цо верха) на рабочий раствор
мономеров наслаивают воду, содержащую некоторое количество смеси
инициаторов полимери-.зации.
н: Использование трубок для ИЭФ совершенно необходимо
только тогда, когда требуются строго анаэробные условия или минусовая
температура при фракционировании. За исключени-"ем этих частных случаев,
сегодня подавляющее большинство экспериментаторов, как правило,
предпочитает проводить ИЭФ в горизонтальных пластинах и особенно в
ультратонких гелях.
.3.2.17. Микро-ИЭФ
Распространенные в настоящее время методы ИЭФ в трубках или пластинах
геля позволяют регистрировать белки на ^уровне нескольких микрограммов.
Однако при работе с очень небольшими количествами белка может
понадобиться специальная система, позволяющая проводить регистрацию и на
уровне шанограммов. В одной из систем такого типа (Grossbach, 1972)
214
Глава 3
ИЭФ проводят в кварцевых капиллярах сечением 50, 100 и 300* мкм и длиной
65 мм (производства Heraeus Quarzshmelze, На-nau, Germany). В состав
гелей входят акрил амид (7%), амфолины (2%), сахароза (20%). Образец,
содержащий по 20-70 нг каждого белкового компонента, вносят в раствор
мономеров до полимеризации. Разделительные микротрубочки заполняются за
счет капиллярных сил. После полимеризации концы капилляров заполняют 2%-
ным раствором амфолинов с помощью микропипетки с микроманипулятором.
Затем капилляры присоединяют к обычному прибору для электрофореза с
помощью короткой стеклянной трубки и пробки из силиконовой резины с
отверстием. ИЭФ проводят при комнатной температуре и напряжении 100 В в
течение 10-120 мин. Сразу же после ИЭФ гели выталкивают из капилляров с
помощью плотно пригнанного стального поршня на вогнутое стекло с
небольшим количеством 20%-ной ТХУ. Разрешение при ИЭФ в таких капиллярах
сопоставимо с разрешением в обычных 3-5-мм трубках. Однако в капиллярных
гелях, как правило, наблюдается продольное смещение картины распределения
белков, а при длительном фокусировании зоны мигрируют к одному из концов
геля и в конце концов выходят в электродный раствор. По-видимому, это
связано с интенсивным электроэндосмотическим потоком вдоль стенок
кварцевой трубки. Этот поток, вероятно, становится особенно ощутимым из-
за высокого отношения площади внутренней поверхности капилляра к объему
геля.
В работе Gainer, 1973, описан микрометод, позволяющий регистрировать
белки на уровне 10-10-10-9 г. Автор полимеризо-вал 7,5%-ный или 5,5%-ный
ПААГ, содержащий амфолины в концентрации 2%, в стеклянных капиллярах
(типа Corning 7740; внутренний диаметр 0,58 мм, наружный 1,15 мм, длина 7
см). После полимеризации гели устанавливали в специальный прибор для
микроэлектрофореза (Gainer 1971) таким образом, что верхняя часть каждого
капилляра попадала в анодную камеру, содержащую 0,3%-ную H2SO4, а нижняя
- в катодную камеру, содержащую 0,5%-ный этанолдиамин. Для удаления
избытка персульфата проводили предварительное фокусирование в течение 30
мин, а затем образцы (по 5-50 нг каждого компонента в образце) наносили в
верхнюю часть капилляра. При напряжении 120 В и комнатной температуре за
3 часа достигалось равновесие. Белковые зоны в микрогеле после
окрашивания проявлялись в виде очень узких полос (меньше 0,2 мм), что
позволяло регистрировать вплоть до 10-10 г белка в зоне. В работе Gainer,
1973, при ИЭФ в микрогелях для многих щелочных белков были обнаружены
более высокие значения pi, чем при ИЭФ в обычных гелях. Возможно, при
работе с микрогелями в меньшей степени сказывается поглощение СОг из
воздуха,
Аналитическое ИЭФ
215
Ijto весьма ценно для ИЭФ в щелочной области pH. Дополни-!"ельные
сведения по микро-ИЭФ можно найти в книге "Микрометоды в молекулярной
