Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
покрывают куском вымоченной заранее целлофановой пленки, а затем
пластиной из пористого пластика. •Сверху все это покрывается закрепленной
в приборе мягкой герметизирующей крышкой из силиконовой резины. Прибор
подсоединяется к водоструйному или масляному вакуумному насосу,
одновременно включается система нагревания. Время сушки должно независимо
подбираться в каждой лаборатории, поскольку оно зависит от типа геля (а
также от глубины вакуума и эффективности системы нагревания). При
несвоевременной разгерметизации системы (до полного высыхания) происходит
необратимое растрескивание геля. После сушки получают -"сэндвич", в
котором высушенный гель находится между слоем фильтровальной бумаги и
защитной целлофановой пленкой.
Все эти операции оказываются ненужными при работе с ультратонкими гелями,
фиксированными на полиэфирной под-
Аналитическое ИЭФ
21"
ложке. После вымачивания геля в 3%-ном глицерине его можно высушить
просто на воздухе или в сушильном шкафу пр" 40-50 °С. Было описано
несколько лабораторных способов высушивания гелей без использования
упоминавшихся выше приборов (Lin et al., 1969; Hebert, Strobbel, 1974;
Maizel, 1971;. Mayer, 1976). После фокусирования пептидов в ультратонком;
геле на него накладывают кусок фильтровальной бумаги (ватман ЗММ) и
тотчас же помещают в сушильный шкаф на 110°С. За несколько минут гель
полностью высыхает, благодаря чему пептиды фиксируются в зонах своих pi.
После этого бумагу можно опрыснуть набором специфических красителей для
аминокислот - так, как это делается с бумажными хроматограммами (Gianazza
et al., 1979b).
3.2.16. ИЭФ в цилиндрических гелях
•
В большинстве случаев для ИЭФ используют цилиндрические гели таких же
размеров, как и для обычного аналитического электрофореза, т. е. длиной
5-15 см и диаметром 0,2-0,5 см. Некоторые авторы используют для ИЭФ также
традиционные-электрофоретические аппараты, однако мне кажется, что почти
все системы этого типа можно было бы существенно улучшить путем
организации более эффективной системы охлаждения и переустройства
электродных отсеков. Простой способ решения проблемы теплоотвода с
помощью термостатирования трубок геля в циркулирующем охлаждаемом
электродном растворе был предложен в работе Fawcett, 1968. Автор учел
также необходимость минимизации объема электролитов и предложил
остроумное решение проблемы - погружать платиновые электроды прямо в слой
раствора амфолинов в верхней части каждой трубки. В работе Righetti,
Drysdale, 1971, описана разработанная авторами конструкция аппарата для
ИЭФ в трубках. Его важнейшие особенности - это эффективная система
охлаждения, малый объем электролитов и максимально сближенное взаимное
расположение электродов и гелей. Этот аппарат схематически изображен на
рис. 3.21. Трубки с гелем находятся в изолированном центральном отсеке
между электродными камерами. В этом отсеке непрерывно циркулирует
охлаждающая жидкость. Наружная цилиндрическая стенка центрального отсека
примерно на 2,5 см возвышается над горизонтальной верхней перегородкой,
образуя верхнюю электродную камеру. Нижняя электродная камера сделана в
виде отдельного блока, являющегося основанием всей конструкции. В
качестве электродов-используются кольцевые платиновые проволочки. Верхний
электрод смонтирован на внутренней стороне крышки, а нижний - на
внутренней стороне нижней электродной камеры. Обai
14'
212
Глава 3
Рис. 3.21. Схематическое изображение аппарата для аналитического ИЭФ в
трубках (Righetti, Drysdale, 1971, 1973). 1-верхний электродный отсек с
системой аварийного отключения, 2 - нижний электродный отсек. После
замены центрального отсека (3) система может быть использована для
препаративного ИЭФ в гелях. (С любезного разрешения Medical Research
Apparatus.)
конца трубок контактируют с жидкостью в электродных камерах и фиксируются
уплотнительными резиновыми кольцами в соответствующих отверстиях в
верхней и нижней перегородках. После сборки аппарата электроды
располагаются на расстоянии менее 1 см от концов трубок. Через
специальное отверстие в верхней крышке аппарата (которая свободно
вращается вокруг центрального опорного стержня) образцы наносят прямо на
поверхность гелей, не снимая крышки. Через это же отверстие верхнюю
камеру при необходимости можно заполнить газом. Небольшие отверстия для
отвода или заполнения газом прорезаны также в верхнем ободке нижней
камеры. Наконец, на крышке камеры поставлен контрольный прерыватель,
связанный с обоими электродами, который замыкает электрическую .цепь
только при правильной установке крышки на центральном
Аналитическое ИЭФ 213
Щорном стержне. При поднятии крышки или при случайном йфпении аппарата
прерыватель срабатывает и отключает напряжение от обоих электродов. В
прибор обычно вставляют 12 Трубок длиной 10 см с внутренним диаметром 3
мм (объем рколо 1 мл), но, поменяв резиновые втулки, можно использовать
jsji трубки другого диаметра. Предпочтительное использование 3-мм гелей
