Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
них круглыми или щелевидными отверстиями. Впервые этот метод был описан в
работе Altland, 1977. Теперь, стоит только поставить дополнительный
третий электрод (катод или анод) в середину геля, по обеим сторонам от
него наложить две ленты из силиконовой резины - с 48 круглыми отверстиями
в каждой - и можно анализировать 96 образцов в одном геле (рис. 3.20).
Сообщалось также об использовании для внесения, образцов пластикового
шаблона с прямоугольными отверстиями (Ghuat, Pi-lon, 1977).
Обычно стараются расположить полоски для внесения образцов в той части
геля, где не происходит фокусирования основных компонентов. Во избежание
неблагоприятного воздействия экстремальных значений pH не следует вносить
образцы слишком близко к электродам. Расстояние между местом внесения
образца и ближайшим электродом должно составлять 10-15% всей длины геля.
Лучше всего вносить образцы в гель с уже сформировавшимся градиентом pH.
Полоски для внесения образцов следует накладывать на поверхность геля
аккуратно, избегая попадания пузырьков воздуха.
При работе с цилиндрическими гелями образец наносят непосредственно на
верхний срез геля или вводят в состав геля до полимеризации. Наносить
образец сверху можно на любом этапе ИЭФ, при этом для увеличения
плотности раствора образца к нему следует добавить глицерин или сахарозу
до концентрации 5-10%, а также амфолиты-носители до концентра-
Аналитическое ИЭФ
209"
ции 2-4%. Присутствие амфолитов предохраняет образец в процессе его
проникновения в гель от прямЪго контакта с кислотой1 иди щелочью в
электродном растворе. Добавление следовых количеств бромфенолового синего
или другого не связывающегося' с белками красителя существенно облегчает
контроль за ходом, нанесения бесцветного образца. Введение образца в гель
до полимеризации целесообразно в случае анализа больших объемов-
разбавленного материала. Этот способ пригоден только в том случае, если
образцы не подвержены неблагоприятному влиянию со стороны компонентов
гелеобразующего раствора или тепла, выделяющегося при полимеризации;
отметим, что температура " геле в процессе полимеризации может возрастать
до 40 °С (Righetti, Righetti, 1975).
При анализе белков, присутствующих в моче, спинномозговой жидкости и
других физиологических жидкостях, возникают-две серьезные проблемы -
низкое содержание белка и высокая концентрация соли. Это затрудняет
непосредственное проведение ИЭФ. Изящное решение проблемы было предложено
в работе Vesterberg, Hansen, 1978. Белки адсорбируют из жидкости? на
маленькой колонке с гидрофобным гелем - фенил-сефаро-зой, что позволяет
их одновременно сконцентрировать и обессолить. Элюция достигается при
непосредственном нанесении сорбента на поверхность геля. Сочетание низкой
ионной силы при ИЭФ, низкой температуры в геле1) и высокой напряженности?
Рис. 3.20. Трехэлектродная система ИЭФ в геле, позволяющая удвоить число*
одновременно тестируемых образцов. (Из каталога G фирмы Bio Rad 1981.У
¦> Поскольку при понижении температуры гидрофобные взаимодействиям
усиливаются, а не ослабевают, следует признать, что низкая температура в
ге-
ле в данном случае едва ли может положительно сказываться на десорбции*
белков с фенил-сефарозы. - Прим. перев.
14-1488
210
Глава 3
поля способствует весьма эффективному движению адсорбировавшихся белков
от сефарозной матрицы по направлению к -своим pi. Любопытно, что
аналогичный подход оказывается -очень ценным и при элюции белков с
сорбентов в случае аффинной хроматографии (Haff et al., 1979).
0.2.15. Высушивание гелей
Хотя гели можно хранить и во влажном состоянии, запечатав их с помощью
простых приспособлений между двумя прозрачными пластиковыми пленками (Yu,
Spring, 1978), для детектирования и регистрации радиоактивности (методом
радиоавтографии или флюорографии) необходимо использовать высушенные
гели. При высушивании без какой-либо подложки полиакриламидные гели
сжимаются и деформируются. С помощью подложки из фильтровальной бумаги
гель удается высушить с сохранением первоначальных размеров благодаря его
прочному сцеплению с бумагой. В настоящее время целый ряд фирм (Bio Rad,
LKB, Pharmacia) выпускает приборы для сушки пластин ПААГ, основанные на
принципе одновременного воздействия вакуума и нагревания. После
фиксирования белков, окрашивания и отмывания фона гель вымачивают в
течение нескольких часов (для ультратонких гелей достаточно 30 мин) в 3-
5%-ном глицерине, содержащем достаточное количество метанола для
предотвращения разбухания. В случае градиентных гелей необходимо повысить
концентрацию глицерина до 10-15%, иначе наи-•более плотные участки геля
при высушивании могут растрескаться. На сетчатую подложку прибора,
сделанную обычно из нержавеющей стали, накладывают два листа
фильтровальной ¦бумаги типа ватмана ЗММ. На эти листы аккуратно кладут
гель таким образом, чтобы между бумагой и гелем не осталось пузырьков
воздуха, которые могут вызвать растрескивание геля при сушке. Гель
