Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
примыкающих к электродам, выделяется больше тепла, чем в остальном геле
(Davies,
1975). По мере установления градиента pH области повышенного выделения
тепла расширяются и перемещаются к центральной части геля. При высокой
электрической нагрузке участки локального перегрева можно выявить потому,
что над ними отпотевает внутренняя поверхность электродной крышки.
Аналитическое ИЭФ
201
3.2.12. Готовые пластины геля
Выпуск готовых полиакриламидных пластин для ИЭФ был впервые налажен
фирмой LKB (Ampholine PAG plates). Гели толщиной 1 мм заполимеризованы на
тонкой пластиковой пленке, что позволяет легко манипулировать с ними.
Выпускаются готовые пластины для ИЭФ в различных интервалах pH - широком
(3,5-9,5) и в нескольких узких (4-5; 4,0-6,5 и 5,5-8,5). Пластина с
диапазоном pH разделения 4-5 предназначена для фракционирования
фенотипических вариантов си-антитрипсина, фокусирующихся именно в этой
области pH. Кроме того, выпускаются пластины для определения НЬА[С
(гликозилированного производного нормального гемоглобина НЬА взрослого
человека, уровень которого характеризует состояние больных диабетом) с
номинальным диапазоном pH разделения 6-8. В этих пластинах помимо
амфолинов содержится, по-видимому, дополнительный амфотерный компонент
("разделитель"), что позволяет получить более пологий градиент в области
pH 7 и тем самым повысить разрешение двух близких зон НЬА и НЬАи. Недавно
фирма Serva начала выпускать свою серию готовых пластинок (Servalyt
Precotes). Эти пластинки имеют две основные отличительные особенности:
во-первых, гели ковалентно пришиты к прочной полиэфирной подложке
(толщиной 180 мкм) типа Gel-fix, во-вторых, сами гели - ультратонкие,
толщиной 100 мкм (об ультратонких гелях см. разд. 3.2.13). Выпускаются
пластины с сервалитами нескольких рабочих диапазонов pH: широкого (3-10),
четырех диапазонов по 3 ед. pH (3-6; 4-7; 5-8 и 6-9), двух диапазонов по
2 ед. pH (4-6, 5-7) и, наконец, двух диапазонов по 1 ед. pH (4-5 и 7-8).
Следует отметить что наличие готовых пластин гелей для ИЭФ имеет особое
значение для клинических анализов, когда ежедневно приходится исследовать
множество образцов. В настоящее время фирма Serva помимо амфолитов-
носителей тех диапазонов, что перечислены в разд. 1.6.2., выпускает
дополнительно серии сервалитов с протяженностью рабочих диапазонов в 3
ед. pH (3-6, 4-7, 5-8 и 6-9), в 1 ед. pH (2-3, 3-4,
4-5, 5-6, 6-7 и 7-8) и даже в 0,5 ед. pH (4-4,5; 4,5-5;
5.0-5,5 и 5,5-6). Кроме того, предлагается новый препарат с широким
диапазоном pH 3-10 (iso-dalt grade), который, как утверждается, позволяет
получать хорошо воспроизводимые картины ИЭФ при двумерном разделении (по
принципу О'Фарел-ла). Фирма LKB также недавно начала выпуск новой серии
амфолинов (1818) следующих диапазонов pH: 3,5-9,5; 2,5-4,5;
4.0-6,5; 5,0-8,0. Это хорошо сбалансированные композиции, позволяющие
получать стабильные линейные градиенты pH при ИЭФ как в полиакриламидных,
так и в агарозных гелях.
202
Глава 3
3.2.13, ИЭФ в ультратонких полиакриламидных гелях
Этот метод является одним из самых замечательных достижений в области ИЭФ
в пластинах ПААГ. Он был разработан и описан в работах Gorg et al., 1977,
1978, 1979а,b, 1980а. Поскольку ультратонкие полиакриламидные гели сами
по себе не обладают достаточной прочностью и рвутся в процессе
окрашивания или обесцвечивания, их необходимо фиксировать на какой-либо
прочной подложке. Поначалу для этой цели использовали целлофановую
пленку, однако сейчас мы предпочитаем работать с полиэфирными пленками
(типа Gel-fix фирмы Serva или PAG-foils фирмы LKB). Не следует путать
полиэфирные подложки этого типа с пленками Gel-bond фирмы Marine
Colloids. Последние предназначены для ИЭФ в агарозном геле и имеют одну
гидрофобную и одну гидрофильную поверхность, образованную тонким слоем
высушенной агарозной пленки. Пленки для полиакриламидных гелей получают
путем частичного поверхностного гидролиза полиэфирной матрицы в 6 N NaOH
и последующей обработки обеих поверхностей силанольными эфирными
производными (Radola, 1980). Считается, что после такой обработки ПААГ
пришивается к подложке ковалентными связями. Образование истинных
ковалентных связей между гелем и пластиком мне представляется
маловероятным. Скорее всего химическая обработка приводит к возникновению
сетки микротрещин, благодаря которой гель прочно сцепляется с
поверхностью пленки. Так, гели, полимеризованные в присутствии
детергента, соскальзывают с подложки, что указывает на отсутствие
ковалентных связей (см. Valkonen et al., 1980). Гели тол-
Рис. 3.15. Сборка формы для приготовления ультратонкого слоя
полиакриламидного геля на полиэфирной подложке: 1-стеклянная пластина
толщиной 3 мм, 2 - П-образная прокладка, вырезанная из листа парафильма
(толщина одного слоя-120 мкм), 3-полиэфирная пленка, (Gorg et al., 1978.)
Аналитическое ИЭФ
203
i|
Рис. 3.16. Форма для приготовления ультратонких гелей. Чтобы облегчить
