Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
пластико-
Аналитическое ИЭФ
195
Рис. ЗЛО, А. Устройство камеры Multiphor 2117 (фирма LKB). Электроды
установлены так, чтобы фокусирование осуществлялось в поперечном
направлении (10 см). 1 и 2 - платиновые проволочные электроды (анод и
катод соответственно) для ИЭФ в поперечном направлении, 3 - нижняя крышка
с вмонтированными электродами, 4а и 46 - электродные полоски
фильтровальной бумаги (анод и катод соответственно), 5 - плоский
полиакриламидный гель, заполимеризованный на стеклянной пластине толщиной
1 мм, 6 - блок охлаждения, 7 - кабель, идущий к источнику питания, 8 -
защитная верхняя крышка, Б. Устройство камеры Ultrophor 2217. Обратите
внимание на подвижные электроды и плотно прилегающую нижнюю крышку,
предотвращающую испарение влаги с поверхности геля. Камера
устанавливается в горизонтальном положении при помощи винтовых ножек. (С
любезного разрешения LKB
Produkter АВ.)
выми прокладками ("спейсерами"), покрытыми тонким слоем водоотталкивающей
смазки, обычно составляет 1-2 мм. Пластины прочно прижимают друг к другу
зажимами таким образом, чтобы исключить подтекание жидкости из внутренней
полости
13*
196
Глава 3
Рис. 3.11. Форма для заливки полиакриламидного геля для ИЭФ на Multi1'
phor 2117. 1-зажимы, 2 - стеклянная пластина размером 125x260x3 мм, 3 -
стеклянная пластина размером 125x260x1 мм, 4 - резиновая прокладка* 5 -
отверстие для заливки рабочего раствора мономеров. (Davis, 1975.)
(рис. 3.11). Как уже упоминалось, на одной из пластин (пластиковой) могут
быть смонтированы зубцы, на месте которых на поверхности геля появляются
лунки для внесения образца. Высота зубцов не должна составлять более чем
30-50% от толщины слоя геля. Более глубокие лунки могут заметно сказаться
на электропроводности соответствующих участков геля и привести к
локальным искажениям градиента pH. Избежать таких, искажений можно,
заполнив лунки густой суспензией сефадекса с рабочим содержанием
амфолитов-носителей. При небольшом числе исследуемых образцов или в том
случае, когда нужно проанализировать образцы в различных условиях,
внутреннюю полость камеры при заливке геля можно разделить на несколько
частей соответствующими перегородками. Как правило, гели заливают и
полимеризуют при вертикальном положении камеры (рис. 3.12). Обе пластины
должны быть очень тщательно вымыты. Одну из пластин можно покрыть
специальным составом (Kodak Photo-Flow с разведением 1: 1000) для более
легкого отделения от поверхности геля. Рабочий раствор заливают в форму
при помощи шприца или пипетки с узким кончиком. Целесообразно первые
порции раствора заливать,
Аналитическое ИЭФ
197
слегка наклонив камеру, с тем, чтобы предотвратить образование воздушных
"карманов". По мере заполнения камеру надо постепенно переводить в
горизонтальное положение. Высота геля должна соответствовать расстоянию
между электродами. После заполнения камеры входное отверстие следует
закупорить уплотнительной резинкой во избежание контакта с воздухом. При
работе с полностью замкнутыми камерами для заливки отпадает необходимость
наслаивать воду на верхнюю кромку геля. В случае приготовления геля в
камере с открытым верхом на рабочий раствор следует наслоить воду,
содержащую следовые количества инициаторов полимеризации, чтобы выровнять
кромку и обеспечить равномерную полимеризацию геля. После завершения
полимеризации камеру в горизонтальном положении помещают в холодильный
шкаф или на поверхность блока охлаждения. За счет сжатия при охлаждении
гель частично отходит от верхней пластины, что облегчает ее последующее
удаление. Непосредственно перед началом работы с гелем следует осторожно
удалить верхнюю пластину. Для этого форму кладут на стол и поднимают
верхнюю пластину, поддевая ее
Рис. 3.12. Последовательность операций в ходе приготовления геля:
заполнение формы (А), фотополимеризация полиакриламидного геля (Б) и
удаление верхней стеклянной пластины с поверхности геля (13). Для
выполнения последней операции лучше пользоваться двумя шпателями. Узким
шпателем (1) слегка прижимают гель сверху, а более широкий шпатель (2)
медленно поворачивают, как показано стрелкой. Когда пузырьки воздуха
начинают проникать между поверхностью геля и верхней стеклянной пластиной
(3), широкий шпатель осторожно поворачивают на 90°. Стеклянную пластину
(3) удаляют. При этом необходимо следить за тем, чтобы гель не отделялся
от нижней стеклянной пластины (4), что могло бы привести к заметному
искажению зон при последующем ИЭФ. (С любезного разрешения LKB Produkter
АВ.)
198
Глава 3
Эффективное охлаждение пластины геля'
Рис. 3.13. Установка стеклянной пластины с ПААГ на блок охлаждения.
Поверхность блока предварительно смачивают раствором неионного
детергента, керосином или легким парафиновым маслом. Затем осторожно
накладывают пластину таким образом, чтобы избежать задержания пузырьков
воздуха. Это обеспечивает равномерность охлаждения. (С любезного
разрешения LKB Рго-
