Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 77

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 71 72 73 74 75 76 < 77 > 78 79 80 81 82 83 .. 171 >> Следующая

обеспечивающим вакуум около 0,1 мм ртутного столба, а также присоединять
колбу через трехходовой кран к баллону с азотом. Тогда после деаэрации
содержимое колбы вновь заполняется не воздухом, а азотом. Для более
эффективного удаления кислорода содержимое колбы в процессе откачивания
следует слегка подогревать и, уж во всяком случае, не охлаждать.
3. Добавляют 5 мкл и 1 мкл растворов ТЕМЭД и персульфата аммония (в
расчете на 1 мл раствора мономеров и именно в такой последовательности) и
быстро перемешивают.
4. Сразу же заливают раствор в собранную плоскую форму или разливают по
трубкам. В форму жидкость наливают да переполнения, а в трубках оставляют
0,5-1 см до верхней кромки, с тем чтобы наслоить сверху разбавленный
раствор катализаторов для предотвращения образования мениска и
обеспечения равномерной полимеризации геля.
5. Полимеризация должна проходить при комнатной температуре и занимать не
более 30 мин. За это время гели с обычным уровнем сшивки (2-5% С)
полимеризуются не менее чем на 95%. В случае высокосшитых гелей (>10% С)
может потребоваться полимеризация в течение ночи. При необходимости гели
можно термостатировать при 40-50(ОС, что заметно ускоряет процесс
полимеризации. При тщательной герметизации готовые гели можно хранить
несколько недель.
Замечания. 1. Все реактивы, использующиеся для приготовления геля, должны
быть самой высокой степени очистки. В частности, акриламид следует
перекристаллизовать для удаления следов свободной акриловой кислоты,
которая, как правило,
Аналитическое ИЭФ
18"
присутствует в любых фирменных препаратах акриламида. Примесь акриловой
кислоты влечет за собой появление на матрице иммобилизованных
отрицательных зарядов, что приводит к электроэндосмосу и нестабильности
градиента pH. Перекристаллизацию акриламида можно проводить из
хлороформа, а биса^ из ацетона (по Loening, 1967). Некоторые фирмы (в
частности, Bio Rad, BDH, LKB и Polysciences) выпускают очищенные
препараты акриламида вполне удовлетворительного качества. Следует также
помнить, что непрореагировавшие мономеры могут связываться с амино- и
сульфгидрильными группами, а также с фенольными гидроксилами (белков),
особенно в сильно щелочной среде. При pH 9 реакции этого типа идут
медленно, а при pH 11 - довольно быстро (за времена порядка 30 мин)
(Dirksen, Chrambach, 1972).
2. В качестве инициатора полимеризации можно использовать и рибофлавин
или ФМН при конечной концентрации 656 мкМ. Растворы помещают на
расстоянии 10 см от лампы дневного света (типа Philips TL 20 W/SS) и
проводят полимеризацию при комнатной температуре не менее 8 ч. Считается,
что за 1 ч превращение мономеров протекает не более чем на 60%
(Brackenridge, Bachelard, 1969), поэтому гели, полимеризо-вавшиеся только
в течение 1 часа, как правило, липкие и мягкие (так же как и гели,
"сшитые" с помощью ДАТД).
3. Пористость и механическую прочность гелей можно регулировать, изменяя
объемное соотношение раствора мономеров и воды, взятых для приготовления
рабочей смеси для заливки геля.
4. Дополнительные компоненты типа сахарозы, мочевины и неионных
детергентов можно добавить на 1-й стадии.
5. Добавление ТЕМЭД не обязательно, поскольку сами амфолиты-носители
могут выполнять аналогичную каталитическую роль при полимеризации (Riley,
Coleman, 1968).
6. На ход полимеризации и физические свойства полиакриламидных гелей
оказывает влияние целый ряд факторов (см. Rodbard, Chrambach, 1971;
Chrambach, Rodbard, 1972). Это означает, что весь процесс должен быть
предельно стандартизован. Особое внимание следует обратить на (1) чистоту
реагентов, (2) условия деаэрации, (3) количественный и качественный
состав набора инициаторов полимеризации, (4) температуру,
(5) продолжительность полимеризации. По-видимому, наиболее вероятным
источником артефактов является используемое количество персульфата. Его
препараты могут заметно различаться по активности, и необходимое
количество приходится подбирать методом проб и ошибок. Следует брать
минимум этого реагента, обеспечивающий нормальное гелеобразование,
поскольку персульфат может окислять амфолиты-носители и вы-
190
Глава 3
зывать небольшие изменения в градиенте pH. При избытке персульфата в
среде образуются в заметном количестве реакционноспособные свободные
радикалы (Brewer, 1967; Fantes, Fur-minger, 1967; Mitchell, 1967), и,
если их не удалить до внесения препарата, они могут послужить источником
артефактов (например, вызывать окисление цистеина до цистеиновой
кислоты). Впрочем, по данным Dirksen, Chrambach, 1972, рибофлавин тоже
способен,вызывать окисление тиоловых групп. Похоже, что свободные
радикалы остаются в геле даже после продолжительного электролиза
(Peterson, 1971). И только с помощью предварительного электрофореза в
присутствии тиогликолята, вводимого в гель в количествах, эквивалентных
исходному количеству инициатора полимеризации (1-5 мМ), удается добиться
того, чтобы условия в геле были неокисляющими (Dirksen, Chrambach, 1972).
Предыдущая << 1 .. 71 72 73 74 75 76 < 77 > 78 79 80 81 82 83 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed