Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
440 мл; равновесие устанавливалось лишь через 2-4 сут. Проведение ИЭФ в
этих условиях требовало большой затраты времени и тщательной
стандартизации всех условий эксперимента. 'Определенные сложности
возникали в связи с изоэлектрической шреципитацией образцов, а также в
связи с размыванием зон
• 32
Глава 1
при опорожнении колонки в отсутствие электрического поля. Процесс
регистрации сфокусированных зон был весьма кропотливым, а иногда и едва
ли не безнадежным делом. Разумеется, в таком варианте метод был явно
непригоден для проведения рутинных анализов. Многие недостатки, присущие
методу ИЭФ в градиенте плотности, удалось преодолеть с введением более
удобных антиконвекционных систем, таких, как полиакриламидный гель',
сефадекс или агарозная матрица. Это позволило-полностью 'реализовать
необычайно широкие возможности ИЭФ - высокоэффективного метода разделения
амфотерных макромолекул. Методология ИЭФ в геле в настоящее время
достаточно хорошо разработана как для аналитического, так и для
препаративного вариантов разделения. В заключение отметим, что ИЭФ в геле
- это на редкость благодарное занятие, поскольку при минимуме
квалификации и вложенного труда экспериментатор получает
высококачественные результаты.
1.3. Обобщение принципа ИЭФ
В своей недавней работе, посвященной истории метода, Колин заметил, что
ИЭФ в определенном смысле можно рассматривать как "нулевой" метод, так
как в процессе разделения частицы достигают равновесного положения и
фокусируются в зонах "нулевой" силы (Kolin, 1977). Проанализировав
теоретические основы ИЭФ, он пришел к выводу, что его можно включить в
особую группу методов, основанных на принципе "изо-
"одинаковые" и
перихорического фокусирования"
o = /iW
р'= const
>/,
(от iso -
т
<0 Ft
. ро_____________________
j\ конденсирования
\
V
(Р'1
Напряженность Колонка для Параметр р*',
поля Ф изоперихррического характеризующий фокусирования окружение (среду)
Рис. 1.6. Изоперихорическое фокусирование. Внутри колонки создается
среда, характеризующаяся параметром р", который постепенно изменяется
вдоль оси z [р"~ф(г)]. Частицы вещества, характеризующиеся значением р'
соответствующего параметра, произвольным образом распределены в
разделительной колонке. Предполагается, что в градиенте р" имеется точка,
в которой p'"pw (зона фокусирования, или конденсирования). (Kolin, 1977.)
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ
23
perichoron - "окружение"). Общая особенность подобных методов заключается
в том, что разделяемые компоненты, "мигрирующие в поле движущей силы
вдоль концентрационного градиента, распределяются по колонке в виде узких
стационарных зон. Внутри этих зон устанавливается такое соотношение между
определенными физическими параметрами частиц данного типа и
соответствующими параметрами поддерживающей среды, что для этих частиц
движущая сила стремится к нулю. К процессам такого типа можно отнести
изопикническое, изокондуктив-ное, изодиэлектрическое, изомагнитное,
изопарамагнитное и изодиамагнитное фокусирование". На рис. 1.6
представлена обобщенная схема процесса изоперихорического фокусирования.
К разделительной ячейке (или изоперихорической фокусирующей колонке)
прикладывается поле напряженностью Ф=/(г). Специфическая химическая среда
/>"=<р(2) внутри колонки формируется предварительно или возникает
непосредственно за счет действия поля. Эта среда фактически выступает в
роли источника противодействующей силы, которая, придя в соответствие с
неким физико-химическим параметром р' данного соединения, уравновешивает
внешнюю движущую силу Ф. Таким образом, это соединение попадает в зону
динамического равновесия двух противоположно направленных сил Fv и Fl и
остается в ней. В табл. 1.1 охарактеризованы равновесные методы
разделения, нашедшие применение в биохимии. Это - изопикническое
центрифугирование, изоэлектрофокусирование и электрофорез в градиенте
пористости геля.
Как показано в работе Giddings, Dahlgren, 1971, некоторые параметры,
характеризующие процесс разделения при ИЭФ и
Таблица 1.1. Равновесные методы фракционирования
Метод Поддерживающая среда Определяемый параметр Нижний предел
разрешения
Изоэлектрическое фокусирование Сахароза, полиакриламидный или
агарозный гель ^ рГ> 0,005 р!<>
Изопикническое центрифугирование Сахароза, CsCl р2> о. со о о о"
Электрофорез в градиенте пористости геля Полиакриламидный гель /?з3>
3 000 дальтон6 >
*) Изоэлектрическая точка.
(r)) Плотность (г/см3).
8) Стоксов радиус.
4) AUen Д. С., Hasley, R. A., Talamo R. С. (1974). Am. J. Clin. Pathol.
62, 732-739.
5) Dawin I. B., Wolstenholme D. R. (1968). Biophys. J. 8, 65-70.
e) Для глобулярных белков. Margolis Kenrick К G. (1968). Anal.
Biochem. 25, 347-
Глава 1
равновесном центрифугировании, определяются при помощи.однотипных
уравнений. Это отражает глубокую аналогию существа процессов, лежащих в
основе этих методов. Примечательно, что в истории развития методов
фракционирования два таких события, как появление концепций
