Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
для обеспечения тесного контакта между мембранами, 3 - катод, 4 - анод, 5
- катионообменная мембрана, 6 - анионообменная мембрана, 7 -
разделительные сетки, 8 - мембраны, находящиеся в изоэлектрическом
состоянии.
терных веществ и функционировали в условиях, обеспечивающих их
изоэлектрическое состояние. Устройство этого аппарата показано на рис.
2.20. Несмотря на то что по конструкции он принципиально отличается от
системы Рильбе, процесс образования и поддержания стационарного градиента
pH и в этом случае, по существу, основан на принципе стационарного рео-
электролиза. Для обеих систем были выведены аналогичные уравнения,
описывающие стационарное состояние процесса. В обоих случаях удается
получить аналогичные рабочие диапазоны pH. Как сказано в статье Martin,
Hampson, 1978, "при использовании моновалентных буферных ионов ширина
рабочего диапазона pH находится в пределах 1,5 ед. pH в том случае, когда
только один из ионов обладает буферными свойствами, и в пределах 3,5 ед.
pH, когда оба иона обладают буферными свойствами, при соответствующем
интервале между значениями р/С двух буферных групп".
С поступлением обеих систем в продажу перед экспериментатором могли бы
открыться поистине неограниченные возможности. Совсем недавно появилось
сообщение об использовании еще одного варианта процесса, сочетающего
особенности двух
Препаративное ИЭФ
137
систем и основанного на применении двухкомпонентных буферных растворов
для фракционирования в многокамерном электролизере (Jonsson, Fredriksson,
1981).
2.2. Препаративное ИЭФ в гелях
2.2.1. Проточное ИЭФ по Фоусетту
Горизонтальные системы фракционирования в проточном градиенте плотности
(Fawcett, 1973, 1976) уже рассматривались в разд. 2.1.15. Фоусетт
разработал также конструкцию вертикальной проточной камеры, заполненной
сефадексом в качестве антиконвекционной среды. Следует отметить, что если
для работы в горизонтальном потоке необходимо достаточно сложное
оборудование, то устройство вертикальной системы, напротив, отличается
простотой исполнения. В одном из вариантов метода, описанном в работе
Gianazza et al., 1975, фракционирование синтетических амфолитов проводили
в камере, имеющей только 12 выходных каналов и не оснащенной системой
циркуляции электродных растворов. Фракционирование могло продолжаться
безостановочно в течение нескольких недель, не требуя почти никакого
контроля со стороны экспериментатора. Непрерывная подача образца
обеспечивалась за счет постоянного гидростатического напора жидкости в
колбе Мариотта. Метод Фоусетта основан на принципе проточного
электрофореза, который был впервые описан в работе Svensson, Brattsten,
1949, и Grassman, 1950. Различие между методами проточного ЭФ и ИЭФ
проиллюстрировано на рис. 2.21.
Разделительная фокусировочная камера образована двумя охлаждаемыми
пластинами t23x30 см), расположенными на
" Лоток ЖИДКОСТИ + - Поток ЖИДКОСТИ + '
IIHI
Рис. 2.21. Иллюстрация принципов проточного электрофореза (Л) и
проточного ИЭФ (Б). (Fawcett, 1973.)
138
Глава 2
расстоянии 0,3 см друг от друга. Электродные отсеки отделены от рабочего
пространства камеры закрепленными по бокам полупроницаемыми мембранами.
Мембраны представляют собой пористые полиэтиленовые пластинки, в порах
которых заполи-меризован раствор акриламида. Разделительная камера
заполнена слоем сефадекса G-100 (или гранулированного полиакриламида),
который снизу поддерживается мембранным фильтром. 54 выходных канала,
расположенные в нижней части камеры, подсоединены к многоканальному
перистальтическому насосу.
Проточное ИЭФ обладает определенными преимуществами по сравнению с
фракционированием в колонках, стабилизированных градиентом плотности. Во-
первых, сфокусированные зоны в проточных системах находятся под действием
электрического поля вплоть до выхода из разделительной камеры. Таким
образом, они меньше размываются и перемешиваются, чем при элюции из
обычных градиентных колонок. Количество белка в зоне при проточном ИЭФ
может быть достаточно большим, т. е. метод обладает высокой "пропускной
способностью". Так, Фоусетт сообщал о разделении 500 мг белковой смеси в
день. Кроме того, с помощью этой системы можно работать и в режиме
"каскада", т. е. проводить сначала прикидочное разделение в широком
диапазоне pH, а затем тонкое фракционирование искомых белков в более
узких градиентах pH.
2.2.2. Проточная разделительная камера Квормби
Одним из последних достижений в области проточного ИЭФ является
конструкция, предложенная в работе Quarmby, 1981. Пространственная схема
прибора, а также разрезы в нескольких плоскостях изображены на рис. 2.22,
А и Б. Рабочий раствор прокачивается через разделительную камеру шириной
15 см, длиной 20 см и толщиной всего лишь 2 мм. При этом для отвода
тепла, как и в аналитических системах (см. гл. 3), достаточно охлаждать
только нижнюю поверхность камеры. Разделение проводят, как правило, при
положении заполненной сефадек-сом G-75M камеры под углом 45р к плоскости.
