Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
14 - пластинчатые фильтры (из поливинилхлорида, расположенные между
каналами внутри камеры), 15 - диализная мембрана, отделяющая электродный
отсек, 16 - платиновые проволочные электроды, 17 -вход и выход системы
циркуляции электролитов. (Egen et al.,
1979.)
ющиеся книзу перегородки зафиксированы на расстоянии 1,5 мм от дна
камеры, покрытого тонким слоем пластика (3). Эффективность системы
охлаждения обеспечивается хорошим термическим контактом между пластиком и
охлаждающим горизонтальным алюминиевым блоком (4). Два крайних отсека
содержат "тяжелый" электродный раствор, а центральный - рабочий раствор с
вертикальным градиентом плотности. Вход и выход градиентного потока
контролируется многоканальным насосом, соединенным через систему
капилляров с рядом отверстий, рас-
134
Глава 2
Рис. 2.18. Модель аппарата для ИЭФ в проточном градиенте плотности с
малой длиной пути разделения. А. Поперечное сечение горизонтальной
рабочей камеры (1), разделенной на три отсека перегородками (2). Дно
камеры покрыто тонким слоем пластика (3), контактирующим с блоком
охлаждения (4). Катодные пластинки (5), сделанные в виде проволочной
сетки из нержавеющей стали, погружены в верхний слой проточного градиента
плотности в центральном отсеке. Анодные пластинки (6) из платиновой
проволочной сетки погружены глубоко в жидкость в обоих крайних отсеках.
Б. Продольное сечение торцевого участка камеры с гофрированным
распределительным блоком (7) для подачи и вывода проточного градиента
плотности. В. Желобки распределительного блока. (Fawcett, 1976.)
положенных в распределительных блоках по обе стороны камеры. Отверстия
находятся в нижней части желобков, образованных гофрированной
поверхностью обоих распределительных блоков (7). Эта система позволяет
плавно подавать и выводить из камеры слои градиента толщиной около 0,25
мм. Поскольку охлаждение раствора происходит только через дно камеры,
образуется вертикальный температурный градиент, который, как и
предполагалось в работе Philpot, 1940, дополнительно стабилизирует
проточный градиент плотности. Согласно данным Fawcett, 1976, в таком
приборе можно фракционировать до 1-2 г смеси белков в час. Несмотря на
такие уникальные препаративные характеристики, в литературе нет других
сообщений об использовании этого прибора, хотя его конструкция
представляется мне простой и весьма совершенной.
2.1.17. Стационарный реоэлектролиз
Недавно в работе Rilbe, 1978, был описан совершенно новый подход к
изоэлектрическому фракционированию, названный "стационарным
реоэлектролизом". С его помощью оказывается возможным формирование
стабильного градиента pH за счет
Препаративное ИЭФ
135
стационарного электролиза обычных буферных растворов в сочетании с
дополнительным внешним переносом жидкости между катодным и анодным
отсеками. Принцип действия такой системы проиллюстрирован на рис. 2.19.
Разделение происходит в неподвижной жидкости, находящейся в центральном
отсеке. В то же время и анолит, и католит непрерывно перемешиваются. При
помощи двухканального насоса происходит постоянный взаимный обмен
растворами между электродными отсеками. Скорость работы насосов
подбирается таким образом, чтобы гидродинамический поток полностью
компенсировал электрофоретический транспорт всех ионов электролитов. Если
постоянство электрофоретического и гидродинамического потоков
поддерживается вплоть до установления стационарного состояния, то в
разделительной камере между электродами устанавливается стабильный
плавный градиент pH.
Были проведены расчеты, позволившие предсказать форму градиента pH для
реоэлектролиза в случае солевого буфера, образованного слабой кислотой и
сильным основанием или, наоборот, сильной кислотой и слабым основанием.
Теоретический расчет для случая буфера на основе слабой кислоты и слабого
основания с Ар/С=1 указывает, что должен сформироваться плавный градиент
протяженностью в 2-2,5 ед. pH, центр которого будет располагаться
посередине между двумя значениями рК. Экспериментально удавалось получать
градиенты pH 4-5 и 8,5-9,5 при стационарном реоэлектролизе ацетатного и
боратного буферов соответственно.
Аналогичный подход был описан в работе Martin, Hampson, 1978. Они
использовали электролизер многокамернрго типа, в котором разделительные
мембраны были покрыты слоем амфо-
Рис. 2.19. Иллюстрация принципа стационарного реоэлектролиза, основанного
на непрерывном встречном переносе жидкости между анолитом (2) и като-
лнтом (5). Фракционирование происходит в покоящейся жидкости (7). В
электродных отсеках жидкость непрерывно перемешивается с помощью мешалок
(3) и (6). Двухканальный насос (8) с одинаковой скоростью перекачивает
растворы от анодного отсека к катодному и обратно. 1 - анод, 4 - катод.
(Rilbe, 1978.)
136
Глава 2
От системы охлаждения
Рис. 2.20. Поперечное сечение прибора, разработанного Martin, Hampson,
1978. 1 и 2 - непроницаемая пластиковая пленка, растянутая между опорами
