Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
Конструкция спиральной фокусировочной ячейки, описанная ff работе Chilla
et al., 1973, показана на рис. 2.10, А. На рис.
2.10,5 изображена специально разработанная система присоединения
платиновых электродов (Bours, 1973 с). Фокусирование в полиэтиленовой
трубке (длина 100 см, внутренний диаметр 4 мм, наружный диаметр 6 мм)
проводилось в течение 27 ч при
Препаративное ИЭФ
121
Рис. 2.10. А. Устройство системы для ИЭФ белков в свободной жидкости (в
сплошной спирали). 1-латунная трубка размером 25x170 мм, 2 - щель
размером 4X120 мм, 3 и 4 -фиксаторы (стационарный и подвижный) для
закрепления спирали, 5 -подвеска, 6 -спираль из полиэтиленовой трубки
(внутренний диаметр 4 мм, наружный 6 мм, длина 1 м), 7 и 8 - платиновые
электроды. (Chilla et ah, 1973.) Б. Присоединение платинового электрода в
системе ИЭФ в свободной жидкости. 1 - платиновая проволока, 2 - спайка с
кабелем, 3 - кабель, ведущий к блоку питания, 4 - пластиковая головка, 5
- пластиковый защитный колпачок (18x25 мм), 6 - зазор для выхода газа, 7
- полиэтиленовая трубочка. (Bours, 1973с.)
напряжении 3800 В и силе тока от 850 мкА (в начале) до 160 мкА (в конце
ИЭФ). В литературе имеются сообщения об использовании этого метода для
фракционирования кристаллинов хрусталика (Bours, 1973 а, Ь), глюкозо-6-
фосфатдегидрогеназы (Chilla et al., 1973), рибозофосфатизомеразы (Domagk
et al., 1973, 1974) и фосфорилфосфатазы (Zech, Zurcher, 1973, 1974).
2.1.9. Зонально-конвекционное ИЭФ в соткрытой" спирали
На рис. 2.11 показана конструкция прибора, предложенная в работе Quast,
1977. Принцип действия этой системы такой же, как у спиральных ячеек,
описанных Macko, Stegeman, 1970, и Bours, 1973 с, а наиболее существенные
особенности - это возможность многократного использования спирали,
непосредственный доступ к каждой отдельной фракции и более высокая
допустимая загрузка (на уровне граммов образца). В процессе ИЭФ спираль
погружена в термостатируемую фреоновую баню. Рабочий раствор, содержащий
образец и амфолиты-носители, заполняет витки спирали вплоть до основания
вертикальных отводных трубок. Фракционирование протекает по тому же
принципу, что и в работе Valmet, 1969. Сразу же по окончании процесса
жидкость из верхней части каждого витка отсасывают с помощью системы
шприцев с пластиковыми трубочками на конце, смонтированных на специальной
раме. Таким образом, оставшаяся жидкость в соседних витках оказывается
разделенной пузырьками воздуха. Сама спираль теперь, по сути дела,
представляет собой цепочку из отдельных U-образных трубок, как
122
Глава 2
А Б
Рис. 2. Г1. Система для ИЭФ в открытой спирали. Стеклнпиая спиральная
разделительная трубка; вид с торца (Л), сбоку (Б) и сверху (В). 1-витки
спирали (диаметр витка 6 см, внутренний диаметр трубки 7 мм), 2 - ось
спирали, 3 - электродный отсек на выходе спирали, 4 - вертикальные
отводные трубки на каждом витке спирали. (Quast, 1977.)
в уже упоминавшемся змеевидном аппарате Rose, Harboe, 1970. Спираль,
описанная в работе Quast, 1977, состоит из 37 витков, что соответствует
получению 37 отдельных фракций объемом по
4,5 мл. Прибор достаточно компактен - спиральная стеклянная трубка
имеет внутренний диаметр 7 мм, наружный - 9 мм при диаметре витка около 6
см. В то же время полное расстояние между электродами, т. е. длина
раскрученной спирали, достигает 3,6 м. Это означает, что для ИЭФ в такой
спирали необходимо очень высокое напряжение (автор работал при 25 000 В,
т. е. около 70 В/см). При работе с обычными источниками питания процесс
фокусирования окажется очень продолжительным; например, при 7,5 В/см ИЭФ
будет длиться около 13 сут.
Существенно, что конструктивные особенности "открытой" спирали позволяют
вносить образец уже после того, как градиент pH в основном сформировался,
близко к области pi разделяемых компонентов. Следует отметить, что с
помощью своего прибора автор исследовал также процесс ИЭФ в условиях
постоянного обновления электродных растворов, составленных так, чтобы в
градиенте pH возникал постоянный стационарный поток ионов нейтральной
соли, препятствующих агрегации белков в изоточке. По сути, на том же
самом принципе основан метод "стационарного реоэлектролиза" (разд.
2.1.17).
Препаративное ИЭФ
123
2.1 JO. Жидкостное ИЭФ во вращающихся трубках по Хьертену
Этот метод основан на принципе электрофореза в свободной жидкости в
варианте, предложенном в работе Hjerten, 1967. Как известно, одна из
важнейших проблем методов электрофоретического разделения в свободной
жидкости заключается в необходимости стабилизации зон разделяемых
компонентов без помощи какой-либо поддерживающей среды. Для решения этой
проблемы Хьертен предложил использовать принцип стабилизации вращением,
проиллюстрированный на рис. 2.12. В работах Lundahl, Hjerten, 1973, и
Hjerten, 1976, описано использование этого принципа в приборе для ИЭФ.
Разделительной камерой в этом приборе служит горизонтальная кварцевая
