Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
Фокусирование белка в каком-либо из карманов лотка сопровождается его
концентрированием у дна при
8*
lie
Глава 2
шштт
ё
У///////////Л
Pt
Б
В
Рис. 2.7. Схематическое изображение аппарата Вальмета для зонально-
конвекционного ИЭФ. А. Крышка (1) и лоток (2) в нерабочем положении (до
или после ИЭФ). Б. Крышка и лоток переведены в рабочее положение (во
время ИЭФ). В. Один из электродных отсеков. (Valmet, 1969; с любезного
разрешения LKB Produkter АВ.)
контакте с охлаждаемой поверхностью кармана. Таким образом возникает
локальный вертикальный градиент плотности, перпендикулярный направлению
электрического тока в камере.
По окончании процесса крышку снимают, и жидкость снова стекает в карманы
лотка, который, таким образом, играет и роль коллектора фракций.
Сконцентрированные белковые фракции можно собрать со дна с помощью
перистальтического насоса, а остаток раствора, содержащего амфолиты-
носители, использовать для следующего разделения. При работе с камерой
Вальмета изоэлектрическая преципитация белков является скорее
преимуществом, чем недостатком. Она облегчает детектирование зон и дает
возможность отделить белок от раствора амфолитов просто с помощью
центрифугирования. С другой стороны, неизоэлектрическая преципитация
может привести к значительному загрязнению компонентов.
С помощью своего прибора Вальмету удалось также разделить смесь амфолитов
на фракции с узкими рабочими диапазонами pH. При ИЭФ амфолинов pH 3-10 в
камере с тридцатью ячейками он получил фракции, перекрывающие диапазоны в
0,2-0,3 ед. pH. Загрузка образцом в системе Вальмета может быть
значительно выше, чем в обычных системах ИЭФ в вертикальном градиенте
плотности. Автор сообщал о фракционировании 350 мг сывороточного белка в
50 мл 1 % -ного раствора амфолинов. Таким образом, высокая загрузка по
белку, экономный расход амфолинов и другие преимущества обеспечива-jot
эффективность использования этого прибора для крупно*
Препаративное ИЭФ
117
масштабного ИЭФ. К сожалению, промышленный выпуск прибора такого типа не
налажен, что объясняется главным образом технологическими трудностями,
связанными с его изготовлением.
Метод Вальмета был успешно использован в работе Bodwell, Creed, 1973, для
фракционирования целого ряда различных белков. Аналогичный подход к
препаративному ИЭФ в работе Fawcett, 1975 b, был сделан на основе
модификации устройства, предложенного ранее Kalous, Vacik, 1959. Несмотря
на успешное фракционирование овальбумина в широком диапазоне pH, попытки
разделения компонентов миоглобина в щелочной области pH оказались не
очень удачными. Это скорее всего было связано с малоэффективным
охлаждением и электроосмотическими эффектами. На том же принципе (Valmet,
1969, 1970) был основан и прибор, описанный в работе Rose, Harboe, 1970.
Он представлял собой систему U-образных трубок, последовательно
соединенных через верх в одну волнистую линию. Кирюхин увеличил число
отсеков в аппарате Вальмета с 30 до 48 (Kiryukhin,
1972). Этот модифицированный прибор был использован для выделения чистого
альбумина из кроличьей сыворотки (Troitski et al., 1974 а; Tolkacho,
1974).
2.1.6. Зонально-конвекционное ИЭФ по Тальботу
По счастью, концепция зонально-конвекционного ИЭФ не была забыта и
получила дальнейшее развитие в работе Talbot, 1975, где описана новая,
более практичная конструкция прибора, основанная на принципе Вальмета.
Эта конструкция позволяет не только избежать трудностей, связанных с
неизоэлектриче-ской преципитацией образцов, но также предусматривает
легкий доступ к градиенту pH и возможность автоматического
фракционирования градиента по окончании ИЭФ.
Разделительная камера имеет форму лотка, изготовленного из алюминиевого
блока высотой 2,5, шириной 6,25 и длиной 50 см. Рифленое дно и стенки
лотка образуют 52 желобка ("кармана"). Лоток имеет изолирующее лаковое
покрытие; в его основание вмонтированы охлаждающие змеевики,
обеспечивающие эффективный теплоотвод благодаря непосредственному
контакту с металлом. Имеется также специальная крышка, препятствующая
испарению жидкости. На противоположных концах лотка расположены
электродные пластины. Лоток укрепляется на подставке, может
поворачиваться вокруг длинной оси и фиксироваться в двух положениях -
горизонтальном или под углом 45 к плоскости подставки. Для проведения ИЭФ
в лоток заливают 30 мл 1%-ного раствора амфолинов, который равномерно
распределяют по всем желобкам, покачивая лоток. Затем закрепляют его под
углом 45(0, что обеспечивает электрический
118
Глава 2
Рис. 2.8. Устройство аппарата Тальбота для зонально-конвекционного ИЭФ
(фрагмент). 1 - разделительная камера (лоток)Г2 - крышка, 3 - электродная
пластина, 4 - торцевая пластина, 5 - крепежные стержни из нержавеющей
стали, 6 - установочные винты, 7 - поворотная ось, 8 и 9 - фиксаторы.
(Talbot, Caie, 1975.)
контакт по всей длине разделительной камеры. В качестве анолита
используют 1%-ную фосфорную кислоту, в качестве католита - 1%-ный ТЕМЭД.
