Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
комплексов, представляется перспективным использовать амфолины для
препаративного получения методом ИЭФ или ИТФ белков, предназначенных для
использования в медицине или ветеринарии.
Тем не менее в случае культуры тканей ситуация может быть несколько иной.
Так, в опытах Gierthy et al., 1979, с культурами неделящихся диплоидных
фибробластов из легких человека амфолиты проявляли митогенную активность.
Особенно высока активность амфолинов (фирмы LKB) pH 9-11. Их
стимулирующий эффект достигал 30-50% от величины максимального ответа,
получаемого при стимуляции фактором из тромбоцитов человека. Амфолиты
других марок, включая физолиты (поставляются фирмой Brinkmann), сервалиты
и фармалиты, не обнаруживают существенной митогенной активности. Однако
любые амфолиты-носители в высокой концентрации (выше 2-3 мг/мл) подавляют
рост клеток и обладают цитотоксичностью.
Следует отметить, что если приводимые в цитируемой работе данные по
биологической активности амфолитов представляются достоверными, то
сделанный там вывод о том, что как ми-тогенные амфолины pH 9-11, так и
немитогенные физолиты pH 9-11, фармалиты pH 8-10,5 и сервалиты pH 4-9
содержат высокомолекулярные компоненты (Л4Г = 5000-7000), по всей
видимости, ошибочен. Как было отмечено в разд. 1.10.3, амфолины крайних
диапазонов pH (2,5-4 и 9-1,1) на самом деле характеризуются меньшими
значениями Мт (около 300-400), чем компоненты с буферными свойствами в
интервале pH 4-9 (Bianchi Bosisio et al., 1981; Gelsema et al., 1979).
6'
84
Глава 1
1.10.9. Растворимость амфолитов-носителей в различных растворителях
Амфолиты-носители растворимы в присутствии большинства агентов,
преципитирующих белки, таких, как сульфосалицило-вая кислота или ТХУ.
Преципитация амфолитов не происходит при повышении концентрации ТХУ по
крайней мере до 50% (Radola, 1980 b). Имеющиеся в продаже амфолиты всех
типов и всех диапазонов pH при комнатной температуре осаждаются 0,6%-ной
пикриновой кислотой, вероятно, в результате образования специфических
комплексов (неопубликованные результаты экспериментов, проведенных
совместно с A. Gorg, W. Postel и R. Westermeier). Амфолины фирмы LKB
растворимы в насыщенном растворе сульфата аммония, т. е. в условиях,
которые вызывают обратимую преципитацию большинства белков Nilsson et
al., 1970). Они также растворимы (по крайней мере до 2%-ной концентрации)
в 100%-ном хлоральгидрате - растворителе, применявшемся для электрофореза
белков (Ballou et al., 1974). Однако амфолиты, судя по всему,
модифицируются этим альдегидом, вероятно, с образованием шиффовых
оснований (Brenna et al., 1982). К сожалению, этот растворитель
непригоден для ИЭФ, поскольку при pH>5 он очень активно взаимодействует с
белками. Амфолиты хорошо растворимы в 100%-ном формамиде, традиционном
растворителе для электрофореза ДНК и РНК (Rickwood, Hames, 1981). Тем не
менее при ИЭФ в этом растворителе также не удается получить
воспроизводимые результаты, так как формамид активно гидролизуется вблизи
катода с образованием муравьиной кислоты и свободного аммиака, которые
дестабилизируют градиент pH. Гидролиз не удается подавить, даже используя
слабые католи-ты, например разбавленный раствор триса (неопубликованные
данные, полученные совместно с Е. Gianazza). Недавно мы приступили к
систематическому изучению растворимости амфолинов в присутствии различных
органических растворителей, в основном спиртов, и типичных
дезагрегирующих агентов, таких, как диметилсульфоксид (ДМСО),
диметилформамид (ДМФ) и тетраметилмочевина (ТММ). Было бы очень заманчиво
заменить 8М или 9М мочевину при ИЭФ на какой-либо из этих растворителей,
поскольку, как известно, присутствие мочевины в системе приводит к pH-
зависимому карбамилированию белков. Так, запасные белки злаков
(проламины) хорошо растворяются в спиртах, например изопропаноле, который
мог бы послужить идеальным заменителем мочевины при изоэлектрическом
фракционировании этих белков.
В табл. 1.6 указана растворимость амфолинов (диапазона pH 3,5-10) в
различных водно-органических смесях. Приведен-
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ
85
Таблица 1.6. Растворимость амфолитов-носителей в различных водно-
органических смесях и в растворе сульфата аммония
Компонент смеси
Концентра-
ция
Растворимость амфолинов (22 °С, 2%-ные амфолины pH 3,5-10)
Сульфосалициловая кис- До 5% лота
Трихлоруксусная кислота Пикриновая кислота Сульфат аммония
Хлоральгидрат
Формамид
Сульфолан
Зтанол
Диметилсульфоксид
Диметилформамид
Изопропанол
Тетраметилмочевина
До 50 %4 0,6%
Насыщенный раствор До 100% До 100% До 85%
До 70%
До 65%
До 55%
До 50%
До 45%
То же
Осаждаются
Полностью растворимы
То же Растворимы
*) В смесях с более высокой концентрацией кислоты растворимость амфолинов
не проверяли.
ные данные относятся к 2% -ному раствору амфолинов (в г/100 мл раствора)
при комнатной температуре (22 °С) в отсутствие электрического поля. Можно
полагать, что в условиях ИЭФ растворимость амфолинов будет несколько
