Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
существенной части молекул амфолита, особенно для амфолитов щелочного
диапазона pH. С другой стороны, непосредственное определение молекулярной
массы амфолинов методом гель-фильтрации и осмометрии дает среднее
значение Мг=700. При этом только 0,7% молекул имеют Мг>1000 и 0,03% - Мг
в районе 4000 (Haglund, 1975). Поскольку ученые, как правило, не очень
доверяют данным фирм-поставщиков, следует добавить, что эти данные были
независимо подтверждены в работе Gelsema et al., 1979. Было показано, что
практически во всем диапазоне pH Мг (фарм.) >МГ (амф.) > >МГ (серв.). Для
всех трех марок амфолитов компоненты с наибольшими значениями Мг
обнаружены в кислой, а не в щелочной области, что прямо согласуется с
результатами теоретического анализа (Gianazza et al., 1979а). Были
получены расчетные значения средней молекулярной массы для амфолинов (Мг
= 710) и для фармалитов (Мг = 870).
Мне представляется крайне важным критически проанализировать все эти
данные, поскольку решение вопроса об истинной величине Мг амфолитов
весьма существенно для каждого биохимика, занимающегося ИЭФ белков.
Ряд экспериментальных фактов свидетельствует против концепции
высокомолекулярных амфолитов. Во-первых, при осаждении белков сульфатом
аммония (до 100% насыщения) в растворе остается до 99,99% содержащихся в
смеси амфолитов-носителей (Nilsson et al., 1970). Высокомолекулярные
амфолиты в этих условиях скорее всего должны были бы преципитиро-вать.
Во-вторых, после ИЭФ в геле пептиды, начиная с тех, которые
характеризуются некоторыми минимальными значениями Мг около 1500, т. е.
12-14 аминокислотных остатков, .могут быть зафиксированы и окрашены при
обработке геля смесью краситель-трихлоруксусная кислота (ТХУ) (Righetti,
Chillemi, 1978). Амфолиты-носители в этих условиях полностью растворимы.
Определение Мт имеющихся в продаже амфолитов (за исключением сервалитов,
которые, по-видимому, не окрашиваются) в работе Gierthy et al., 1979,
было основано на данных
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ
73
электрофореза в геле в присутствии ДДС-Na. В этой системе наибольшие
значения Мт 5000-7000 были получены для самых щелочных компонентов (pH 9-
11). В то же время, как нам известно, щелочные компоненты на самом деле
обладают наименьшими значениями Мг в популяции. Как мне кажется, ошибка
авторов заключается в том, что они не учитывают существенного
несоответствия между Мг и электрофоретической подвижностью в присутствии
ДДС-Na, с определенностью установленного в случае щелочных белков
(Panyim, Chalkley, 1971). Более того, известно, что погрешность
определения Мт особенно велика в случае низкомолекулярных щелочных белков
(Podulso, Rod-bard, 1980). Так, для двух щелочных белковых компонентов
миелина с Afr=18 400 и 14300, выделенного из мозга крысы, с помощью
электрофореза в ДДС-Na были получены значения 21 000 и 19 000
соответственно. Более того, если амфолиты плохо связывают или вообще не
связывают ДДС-Na, что весьма вероятно для молекул небольшого размера, то
очевидно, что плотность1 отрицательного заряда у щелочных амфолитов
должна быть значительно меньше, чем у кислых. Это неизбежно должно
проявиться в завышении кажущегося значения Мт при электрофорезе.
Данные по определению молекулярной массы амфолитов тонкослойной гель-
фильтрацией на биогеле Р-10 (Goerth, Radola, 1980) в 25 мМ фосфатном
буфере, pH 7,2, в 2 М мочевине труднее поддаются интерпретации.
Единственное объяснение завышению значений Мг, которые были получены этим
методом, как мне кажется, заключается в возможности образования агрегатов
различного состава из-за взаимодействия между компонентами, входящими в
состав амфолитов. Недавно в работе Gianazza et al., 1979а, было прямо
показано, что процесс ИЭФ амфолинов сопровождается образованием
агрегатов, для разрушения которых необходимо вводить в систему 8 М
мочевину. В этой же работе было установлено, что молекулы щелочных
амфолитов способны связывать значительно больше неионных детергентов типа
нонидета NP-40, чем кислые. Это означает, что щелочные амфолиты более
гидрофобны. Склонность амфолитов к агрегации была выявлена и при помощи
гель-фильтра-ции (Gelsema et al., 1980а). Степень агрегации амфолинов
(LKB) заметно возрастает при повышении их концентрации от 0,6 до 4%. На
основании анализа хроматографического поведения при гель-фильтрации был
также сделан вывод о том, что амфолины широкого диапазона (3,5<р1<10)
состоят главным образом из компонентов, производных ограниченного набора
изомерных полиаминов, вероятно аналогов ПЭГА. При исследовании фармалитов
эти же авторы обнаружили, что в препаратах, выпускавшихся вплоть до конца
1979 г!, содержались вы-
74
Глава 1
Рабочие диапазоны pH амфолинов
Рис. 1.19. Определение средней молекулярной массы Мт амфолинов узких
диапазонов pH на основании данных по измерению осмолярности. Данные
получены при работе с 1%-ными растворами амфолинов, рабочие диапазоны pH
которых указаны по оси абсцисс. (Bianchi Bosisio et al., 1981.)
