Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
65
мы LKB были проанализированы с помощью ионообменной хроматографии на
сульфополистирольной смоле с использованием автоматического
аминокислотного анализатора (Brown et al., 1976). В смеси амфолинов
широкого диапазона pH
3,5-10 удавалось обнаружить 60-70 нингидринположительных компонентов. Для
обеспечения полноты элюции амфолинов с ионообменника приходилось
использовать градиент pH в элюен-те от 3,8 до 11,0. Профиль элюции
щелочных и кислых амфолитов свидетельствует о том, что помимо величины pi
на хроматографическое поведение амфолитов заметно влияют степень их
гидрофобности и молекулярная масса.
В работах Bonitati, 1980, 1981, описан метод обнаружения зон амфолитов-
носителей в УФ-свете непосредственно в слое гранулированного геля или на
бумажной реплике. Флуоресценция амфолитов различных марок убывает в
следующем ряду: еервалиты>амфолины>фармалиты. При облучении
коротковолновым (254 нм) и длинноволновым (350 нм) УФ-светом
сфокусированные сервалиты дают серию четких чередующихся темных и светлых
зон с пурпурной и желто-зеленой окраской соответственно. Как показано на
рис. 1.17, при коротковолновом облучении различимы 56 полос - 29 темных и
27 светлых. При длинноволновом облучении проявляются 50 полос - по 25
каждого типа. Полученные картины распределения комплементарны - положение
большинства полос совпадает, при этом светлой полосе на одной картине,
как правило, соответствует темная полоса на другой, и наоборот. Этот
метод детектирования может быть использован для решения ряда
аналитических задач - для локализации и идентификации определенных
белковых полос в геле или на бумажной реплике, для определения значений
pi сфокусированных белков и для оценки качества различных партий
амфолитов-носителей. На препаративном уровне флуоресценция зон сервалитов
может быть использована в качестве метода косвенного недеструктивного
детектирования белковых зон, для последующего вырезания соответствующих
участков геля и извлечения из них белка.
1.9. Фракционирование амфолитов-носителей
Для получения амфолитов с узким рабочим диапазоном pH могут
использоваться два разных подхода. Первый заключается в варьировании
молярного соотношения амин: кислота в реакционной смеси. Несмотря на
простоту, этот метод с трудом поддается контролю, его недостатком
является загрязненность продукта избытком свободных аминов или кислот
(Righetti et al., 1975 а). Более совершенный подход, используемый и при
производстве коммерческих препаратов, - это изоэлектрическое
5-1488
Темные
полосы
•А-1
254 нм
Яркие
полосы
А
350
- \ °
V/ШУШШ
ШШ
Е
Темные
полосы
_А -1
Рис. 1.17. Флуоресцентные профили изоэлектрического распределения
сервалитов. Идентификация флуоресцирующих полос проводилась по
классификационной системе, предложенной Bonitati, 1980. Стрелками указаны
темные полосы, разделяющие профиль на участки А-Е. Три яркие полосы С-
(8,9,10) -Ь (254 нм) (индекс b от англ. bright) оттенены на рисунке для
того, чтобы подчеркнуть, что они, как правило, темнее других ярких b-
полос. Эта картина распределения в основном воспроизводится от опыта к
опыту. Однако иногда наблюдаются следующие характерные особенности
(описаны по более коротковолновому профилю): (а) участок А оказывается
сжатым, а первые 2-3 полосы в нем
исчезают; (б) для одной партии сервалитов участок А оказался очень
темным, и индивидуальные полосы на нем едва различимыми; (в) в нескольких
опытах между темными полосами В-4-d и В-5-d (индекс d - от англ. dark)
появлялась узкая темная полоса средней интенсивности; (г) полосы (С-(11-
12)-d и три нижние темные полосы на участке D иногда оказываются очень
бледными. Все эти изменения коротковолнового профиля сопровождаются
соответствующими изменениями в длинноволновом профиле. (Bonitati 1980.)
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ
67
фракционирование смеси амфолитов широкого диапазона pi. Наборы амфолитов
с рабочим диапазоном в 1-2 ед. pH могут быть получены с помощью простого
метода (Gianazza et al.
1975), основанного на принципе ИЭФ в потоке (Fawcett, 1973). Этот метод
имеет ряд преимуществ по сравнению с ИЭФ в многокамерных электролизерах
(Rilbe, 1970; Vesterberg, 1969), так как он лишен недостатков, связанных
с осмотическим давлением и возникновением потенциала на мембранах, а
также характеризуется незначительным анодным окислением амфолитов.
На практике применяются оба подхода. Так, фирмы LKB и Serva применяют для
получения амфолинов и сервалитов с узкими диапазонами pi многокамерные
электролизеры. В то же время фирма Pharmacia предпочитает использовать
для этого направленный синтез.
Для разделения амфолитов-носителей пригоден прибор для конвекционного
зонального ИЭФ, описанный в работе Valmet, 1969. С его помощью автору
удалось разделить набор амфолинов pH 3,5-10 на множество фракций с
рабочим диапазоном около 0,2 ед. pH. Впрочем, на самом деле интервал pH,
в котором еще можно успешно проводить изоэлектрическое фракционирование,
