Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
Это, во-первых, проблема проверки качества имеющихся в продаже
препаратов. При ИЭФ амфолиты должны образовывать многочисленные
дискретные зоны, параллельные друг другу и перпендикулярные направлению
электрического поля. Во-вторых, регистрируя зоны амфолитов, можно
контролировать сам процесс изоэлектрического фракционирования. Так,
сильно искаженные или волнообразные зоны могут свидетельствовать о том,
что в препарате содержится значительное количество солей или ионов с
буферными свойствами.
Первые данные о распределении амфолинов при ИЭФ были получены на
основании регистрации зон, характеризующихся изменением показателя
преломления проходящего света (Jons-son et al., 1973; Rilbe, 1973 b).
Авторы предположили, что эти зоны соответствуют зонам хорошо
сфокусированных амфолитов. Существуют два подхода к рефрактометрическому
обнаружению зон (Fries, 1976), Это "теневой" метод, где за основу берется
вторая производная показателя преломления (d2n/d/2 = 0), и метод Топлена
- Шлирена, в котором рассматривается непосредственно форма градиента
показателя преломления (d"/d/ = 0).
В работе Righetti et al., 1975 а, теневой метод был использован для
оценки качества "самодельных" амфолитов-носителей.
<52 Глава 1
Рис. 1.15. Амфолиты, полученные на основе ТЭТА, сфокусированные в
пластине геля. Фотография геля (после ИЭФ) сделана на черном фоне с
боковым освещением. "Пучки" на фотографии отвечают кластерам
сфокусированных амфолитов. Фотографировался прозрачный неокрашенный гель;
детектирование амфолитов основано на измерении коэффициента преломления.
0 - анод, @-катод. (Righetti et al., 1975а.)
синтезированных на основе различных олигоаминов. На рис. 1.15 показана
картина распределения амфолитов, синтезированных из ТЭТА и акриловой
кислоты при соотношении аминный азот: карбоксильный углерод = 2:1. Метод
позволяет различить ряд
Теория я важнейшие аспекты ИЭФ
63
Рис. 1.16. Амфолиты, полученные на основе ТЭПА, сфокусированные в
пластине геля. Все условия такие же, как и в случае рис. 1.15. (Righetti
et al.,
1975а.)
интенсивных зон, которые скорее всего содержат кластеры амфолитов, а не
индивидуальные компоненты. Из данного набора амфолитов нельзя
сформировать плавный градиент во всем диапазоне pH 3-10, распределение
электропроводности по градиенту очень неравномерно, выявляется несколько
больших раз-
64
Глава 1
рывов, соответствующих участкам с очень низким содержанием амфолитов.
Амфолиты более высокого качества могут быть получены на основе ТЭПА. Они
содержат значительно больше компонентов, особенно в кислой области
градиента pH. Кластеры амфолитов более компактны и расположены теснее,
меньше участков с пониженной концентрацией амфолитов (рис. 1.16). Число
компонентов в щелочной области градиента pH меньше, чем в кислой, но
больше', чем в щелочной области градиента, образованного производными
ТЭТА. Тем не менее распределение электропроводности по всей длине геля
крайне неравномерно; с минимумом при pH 5-7.
При проведении синтеза на основе индивидуальных олигоаминов наилучших
результатов удается добиться, используя ПЭГА. В этом случае наблюдается
значительное число зон хорошо сфокусированных индивидуальных компонентов
как в кислой, так и в щелочной области pH, градиент более плавный, а
электропроводность выше и распределена более равномерно, чем в случае
производных ТЭТА или ТЭПА. Естественно, набор индивидуальных компонентов
можно расширить, смешивая в разумных соотношениях амфолиты, полученные
присоединением акриловой кислоты к различным исходным олигоаминам.
Недавно для наблюдения за распределением амфолитов в геле было предложено
(Edwards, Anderson, 1981) сочетание метода Шлирена. (по Fries, 1976) с
использованием решетки Рон-ши (по Kolin, 1958). По мнению авторов,
"волны", наблюдаемые на поверхности геля, образуются за счет осмотических
процессов, которые вызывают перенос воды от участков с пониженной
концентрацией амфолитов к примыкающим зонам.
Были предложены и другие методы детектирования зон при ИЭФ амфолинов.
Так, в работе Felgenhauer, Рак, 1973, их обнаруживали методом
карамелизации глюкозы. После фокусирования в тонком слое сефадекса по
методу Radola, 1973 а, b, на гель накладывали лист фильтровальной бумаги,
смоченный 5%-ным раствором глюкозы. После 8 мин инкубации при 1109С
продукты карамелизации можно было регистрировать по флуоресценции при
возбуждении светом с длиной волны 350 нм или при дневном освещении. Этим
методом удавалось различить 38 дискретных зон в случае имеющихся в
продаже амфолитов диапазона pH 3,5-10.
Еще один метод регистрации основан на образовании нерастворимых
комплексов амфолинов с красителем кумасси фиолетовым в полунасыщенном
растворе пикриновой кислоты в 5%-ной уксусной кислоте. Этот метод
позволяет обнаруживать кислые и нейтральные, но не щелочные амфолины,
которые образуют растворимые комплексы (Frater, 1970). Амфолины фир-
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ
