Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
наиболее качественные амфолиты-носители) практически перестали поступать
в продажу. Большинство фирм прекратило производство этих олигоаминов,
обладающих, как выяснилось, канцерогенным действием. В одной из последних
публикаций (Binion, Rodkey, 1981) в качестве коммерческого источника ПЭГА
указана фирма Columbia Organic Chemicals; Columbia, SC, USA.
Для амфолитов рассмотренного типа характерно наличие четкого минимума
электропроводности при pH около 6 (в диапазоне pH 5,5-6,5). На этот же
диапазон pH приходится минимум буферной емкости и большая часть падения
напряжения в системе. В результате вне этого участка компоненты могут
оказаться "недофокусированными". Рост напряжения на участке с pH 5,5-6,5
- особенно при высоковольтном ИЭФ - может вызвать значительное выделение
тепла со всеми вытекающими неприятными последствиями.
Для устранения этого недостатка методика получения амфолитов была
усовершенствована путем использования в качестве алкилирующих агентов
смеси акриловой и . итаконовой кислот (p/Ci = 3,85 и р/(2=5,45) (Righetti
et al., 1977 а). В результате присоединения к олигоаминам рК
карбоксильной груш пы, принадлежащей остатку итаконовой кислоты и
расположенной в p-положении по отношению к аминогруппе, изменяется от
3,85 до 3,35. При этом р/С у-карбоксильной группы понижается не более чем
на 0,1. Электропроводность амфолитов-носителей, полученных с применением
итаконовой кислоты, в диапазоне pH 5,5-6,5 на 400-500% выше, чем
электропроводность традиционных амфолитов в этом диапазоне.
1.7.2. Метод Шарлионе и др.
Интересная модификация метода Вестерберга была описана в работе
Charlionet et al., 1979, 1981. Известно, что в обычных амфолитах,
производных акриловой кислоты, буферные свойства во всем диапазоне pH 2-
11 зависят главным образом от набора значений рК различных аминогрупп,
входящих в состав исходных компонентов. Несмотря на то что достаточно
широкий спектр кислотных функций, привносимых а-карбоксильными группами (
в фармалитах), p-карбоксильными группами остатков акриловой кислоты, а
также р- и у-карбоксилами остатков итаконовой кислоты, может обеспечить
хорошую буферную емкость в диапазоне pH 2-6, качество амфолитов-носителей
в
56
Глава 1
конечном счете определяется все-таки свойствами самих полиаминов. С
повышением гетерогенности исходной смеси полиаминов повышается качество
синтезируемых амфолитов. Было предложено (Charlionet et al., 1979) до
обработки акриловой кислотой модифицировать смесь полиаминов набором
алкили-рующих агентов. В качестве таких агентов были взяты акрила-мид, N,
N'-метиленбисакриламид (бис), 2, 3-эпоксипропанол-1 и 1, 2, 7, 8-
дизпоксиоктан. В результате модификации происходит превращение первичных
аминогрупп полиаминов во вторичные, а вторичных - в третичные. Более
того, взаимодействие с бифункциональными реагентами (бис, диэпоксиоктан)
приводит не только к модификации аминогрупп, как в случае
монофункциональных акриламида и эпоксипропанола, но и к образованию
межмолекулярных сшивок.
Реакция полиаминов с акриловой кислотой, акриламидом и бисом протекает по
известному механизму нуклеофильного присоединения к p-углеродному атому
а-р-ненасыщенных соединений. Взаимодействие полиаминов с
эпоксисоединениями, вероятно, протекает по следующей схеме:
/°\ ?Н
R-NH, + СН2-СН, -> R-NH-CHj-CH-
О ОН
R\ / \ R. I
"/NH + СН3~СН, ^N-CH,-CH-
r/ R
т. е. приводит к возникновению вторичных и третичных аминогрупп с
примыкающими к ним вторичными р-гидроксильными группами.
Опытным путем удается подобрать соотношение реагентов, дающее
высокогетерогенную смесь модифицированных полиаминов. Обработка такой
смеси акриловой кислотой позволяет получить амфолиты-носители, обладающие
хорошей электропроводностью и высокой буферной емкостью во всем диапазоне
pH 3-10. При помощи ИЭФ получали фракции с очень узкими диапазонами pH
(меньше 0,5 ед. pH), например с диапазоном pH 4,4-4,7 для разделения ai-
антитрипсинов (arAT). В таком пологом градиенте pH удается разделить
фенотипические варианты ai-AT, изоточки которых различаются всего на
0,001 ед. pH. Если учесть, что ранее максимальное разрешение при ИЭФ
оценивалось величиной 0,02 ед. pH (Vesterberg. Svensson, 1966), то
приведенные выше данные свидетельствуют о 20-кратном увеличении
разрешающей способности метода. Впрочем, следует отметить, что
поступившее ранее сообщение о разрешающей способности 0,0025 ед. pH
(Allen et al., 1974) не было подтверждено в последующих работах других
авторов.
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ
57
Опубликованная недавно работа Charlionet et al., 1981, посвящена изучению
факторов, ограничивающих разрешающую способность при ИЭФ в естественном
градиенте pH. Как известно (разд. 1.5.7), разрешающая способность (т. е.
минимальное различие в значениях pi двух белков, при котором еще возможно
их разделение) зависит, в частности, от крутизны градиента pH [(dpH)/dx].
Насколько пологим может быть этот градиент? Вероятно, минимальная
