Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
358
Глава 5
сложнее. Теоретически при частичном окислении агрг должны образовываться
десять различных "валентных гибридов" (Рег-rella et al., 1981). То
обстоятельство, что из десяти возможных форм были обнаружены только
четыре, означает, что остальные формы в данных условиях оказываются
неустойчивыми. Добавляя раствор гемоглобина, частично насыщенного СО, к
водноорганической смеси, содержащей ферридианид, удалось получить
статистический набор частично окисленных СО-содержа-щих тетрамеров. При
низкотемпературном ИЭФ (до - 23'°С) этой смеси удается разделить и
обнаружить все 10 валентных гибридов (рис. 5.18). Этот пример прекрасно
иллюстрирует возможности применения метода ИЭФ для структурных
исследований.
Субъединичный обмен. В физиологических условиях (pH 7,4; 37°С)
кислородсодержащий гемоглобиновый тетрамер легко и обратимо диссоциирует
на сф-димеры:
НЬ, насыщенный Ог или СО: агрг^Зсф; Ка,2С*2 • 10-6 М. Поэтому в растворе,
содержащем два различных гемоглобина, например НЬА и HbS, должно
происходить и образование гибридного НЬ типа ct2(}APs. По сути дела, при
одинаковом соотношении НЬА и HbS 50% тетрамеров будут гибридными. Однако
существование гибридов не удавалось продемонстрировать с помощью обычных
электрофоретических или хроматографических методов, поскольку в процессе
разделения гибридные тетрамеры распадаются на идентичные димеры с
различными зарядами и в таком виде подвергаются фракционированию.
Используя ИЭФ в геле, присутствие гибридных компонентов удается выявить
благодаря тому, что гемоглобин, не связанный с Ог или другими лигандами,
значительно меньше подвержен диссоциации:
Дезокси-НЬ: агРг^^сф; /<4,2-3 • 10~12 М
В работе Bunn, McDonough, 1974, образование асимметричных гибридных
тетрамеров было показано для смеси НЬА и НЬС (рис. 5.19). Наблюдая за
исчезновением гибридной полосы при продолжительном фокусировании, авторы
также оценили константу скорости диссоциации дезоксигемоглобинового
тетрамера на димеры. Она оказалась равной 0,3 ч-1 при pH 7,2, 24РС, что
на порядок отличается от оценки, полученной в работе Nagel, Gibson, 1971.
Образование аналогичных гибридных форм наблюдалось также при
низкотемпературном ИЭФ ( - 20 РС) гемоглобинов, связанных с лигандами
(Perrella et al., 1978). Тот факт, что биологически важные короткоживущие
интермедиаты удается зафиксировать и проанализировать в условиях
низкотемпературного ИЭФ, очень важен, в том числе с точки зре-
Некоторые применения метода ИЭФ____________•___________359
: :
С - г'1 А-
С, % (в исходной смеси) 48 37 34 29 25 22
С, %(ожидаемое значение) 24 14 11 8 6 5
С, % (полученное значение) 27 18 15 10 8 7
Гибридный гемоглобин, % 46 37 34
(ожидаемое значение) 50 45 41
Г ибридный гемоглобин, % 43 38 37 38 33 29
(полученное значение)
Рис. 5.19. Обнаружение "гибридного" гемоглобина агРАрс. Из смесей с
различ-яым содержанием оксигемоглобинов А и С удаляли кислород, после
чего их вносили в гель и фокусировали в анаэробных условиях. Через 60 мин
гели фотографировали и сканировали при 555 нм. Относительное содержание
гемо-глобина С и "гибридного" гемоглобина (оцениваемое с помощью
сканирования) в каждом случае оказывается близким к ожидаемым значениям,
которые .-можно рассчитать, исходя из биномиального распределения
а2+2а6+62= 1.
(Bunn, McDonough, 1974.)
:ния возможностей применения этого подхода к изучению промежуточных
состояний в ферментативных реакциях.
ИЭФ глобиновых цепей. Для четкого выявления синдрома талассемии
необходимо иметь возможность хроматографически .или электрофоретически
разделять свободные от гема глобино-вые цепи и определять их
относительное содержание в образце. В работе Righetti et al., 1979, был
предложен новый метод разделения глобиновых цепей с помощью ИЭФ в
присутствии 8 М. мочевины и детергентов (1-3%-ный нонидет NP-40). В этом
методе, вероятно за счет связывания детергента с белком, достигается
значительно более высокое разрешение р- и у-глобиновых цепей, что
позволяет провести точное денситометрическое или флюорографическое
определение их относительного содержания (см. рис. 3.38). Кроме того, в
присутствии детергента полоса, соответствующая у-цепи, расщепляется на
две зоны, которые, как было показано, отвечают двум фенотипическим
вариантам у-глобиновых цепей эмбриона человека, различающихся только
.природой нейтральной аминокислоты в положении 136. В цепи
360
Глава 5
Нонидет NP-40
А>у-глобиновая цепь
Рис. 5.20. Модель, объясняющая влияние нонидета на разделение Ау и Cv -
глобиновых цепей при ИЭФ. Предполагается, что мицеллы детергента
связываются преимущественно с гидрофобным сегментом 133Met-141Leu Av -
цепи. При этом остаток l32Lys может оказаться экранированным из-за
погружения его в поверхностный слой Штерна или во внутреннее пространство
мицеллы. Таким образом, повышение относительной гидрофобности указанного
сегмента в случае одного из фенотипов (Ау) может стать причиной
потери одного целого положительного заряда. (Righetti et al., 1980.)
