Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
фракционирования тРНК-
21-1488
322
Глава 4
2. ИЭФ гепарина. Было показано, что с помощью ИЭФ можно разделить
гепарин на 21 компонент со значениями р1Каж в диапазоне от 3,2 до 4,2
[Nader et al., 1974; McDuffie et al., 1975]. Считалось, что разделение
обусловлено различиями в молекулярной массе: наименьший размер (Л1Г 3000)
имеют самые "кислые" компоненты, а наибольший (Мт 37 800) - самые
"основные". При этом различия в мол. массе между соседними зонами
составляют около 1500-2000. Фракционирование гепарина с помощью ИЭФ само
по себе еще более достойно удивления, чем разделение нуклеиновых кислот,
поскольку если последние обладают свойствами амфотерных электролитов, то
гепарин является типичным полианионом и не содержит никаких положительных
противоионов. Позднее было замечено, что различные препараты гепарина,
сильно различающиеся по молекулярной массе входящих в их состав
компонентов, при ИЭФ дают заметное количество общих зон (Johnson, Mulloy,
1976). Это свидетельствует о том, что картина разделения гепарина при ИЭФ
определяется не только различиями в значениях Мг, несмотря на то что
наиболее низкомолекулярные компоненты действительно мигрируют в геле с
большей скоростью и "фокусируются" в наиболее кислой области градиента
pH.
Механизм фракционирования гепарина был исследован в работах Gianazza,
1978, и Righetti et al., 1978. На основании спектрального исследования
гепарина в растворе и в геле после ИЭФ, а также на основании данных,
полученных при повторном ИЭФ индивидуальных сфокусированных зон, при ИЭФ
в присутствии и в отсутствие мочевины, при различных количественных
соотношениях гепарин: амфолины и при работе с гепа-ринами, которые
различаются по уровню карбоксилирования и сульфирования, было
продемонстрировано, что наблюдаемая артефактная гетерогенность гепарина
при ИЭФ обусловлена главным образом его взаимодействием с амфолитами-
носителя-ми. В частности, появление 21 зоны при ИЭФ обусловлено
образованием комплексов между одинаковыми макромолекулами гепарина и
различными компонентами смеси амфолинов. Эти комплексы заметно
различаются по прочности. Наименее прочные комплексы, которые легко
разрушаются при действии красителя толуидинового голубого,
характеризуются наиболее высокими значениями р1Каж. В то же время
наиболее "кислые" комплексы очень прочны и не подвержены дезагрегации под
действием избытка основного красителя. Было обнаружено, что в зависимости
от количественного соотношения гепарин: амфолины в растворе может заметно
изменяться стехиометрия комплексов. В случае избытка амфолинов они
ориентируются перпендикулярно гепариновой цепи таким образом, что одна
концевая аминогруппа каждой молекулы амфолинов нейтрализует
Общие экспериментальные аспекты
32$
^^-(c)•KsDo п г ^Ньенз 4g> (r) ^ (s' > n-_
A #<J"4S>R,
' ГС(r)
и
i
ЭО
%
й)П}кг€><"*8>-в-
&**<& L
ct)ocJ*-si
о фб&(r)-Я,
,(&) *
V
"т
:(r)N/Pc<
-R,
Рис. 4.15. Модель взаимодействия между молекулами гепарина и амфолинов.
Слева изображен вариант агрегации при молярном избытке амфолинов,
например в том случае, когда на каждую единицу заряда гепариновой цепи
приходится по одной молекуле амфолинов. Справа изображен комплекс,
образующийся в присутствии относительного избытка гепарина, например в
том случае, когда на каждые три гепариновых заряда при pH = 3,5
приходится по одной молекуле амфолинов. Обратите внимание на то, что при
переходе от одной из этих двух крайних структур к другой изменяется
пространственная ориентация молекул амфолинов: от перпендикулярной оси
гепариновой спирали к параллельной. (Righetti et al., 1978.)
один отрицательный заряд гепариновой макромолекулы. В этих условиях
количество амфолинов, связанных с гепарином, по массе примерно вдвое
превышает массу самого гепарина, т. е. из исходного полимера с Мг 12 600
образуется комплекс с Мт около 37 ООО. При избытке гепарина связанные
молекулы амфолинов ориентированы вдоль гепариновой цепи так, что одна
амфотерная молекула своими аминогруппами нейтрализует примерно три
отрицательно заряженные группы гепарина. На рис. 4.15 показаны обе
модели, отражающие два крайних случая связывания. Понятно, что в
действительности могут реализоваться и самые разнообразные промежуточные
структуры. В обоих случаях свободные протонированные аминогруппы молекул
амфолинов могут участвовать в образовании "поперечных сшивок", или
мостиков, между различными гепариновыми цепями, способствуя формированию
крупных макромолекулярных агрегатов.
3. ИЭФ полианионов. Сейчас уже стало ясно (Gianazza, Righetti, 1978),
что рассмотренные выше факты аномального фракционирования нуклеиновых
кислот и гепарина есть лишь частные случаи проявления значительно более
общей закономерности. Эта закономерность заключается в том, что любые
21*
3214
Глава 4
полианионы склонны к комплексообразованию с амфолитами-носителями в
диапазоне pH 3,2-5,0 (рис. 4.16). Как уже отмечалось, сродство амфолинов
