Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
буферные электролиты (Nguyen, Chrambach, 1977а). Даже в тех условиях,
когда, как считалось, была достигнута стабилизация градиента pH,
наблюдался дрейф зон по направлению к катоду (Nguyen, Chrambach,
1977b,с). Для объяснения дестабилизации градиента pH было предложено семь
различных гипотез (Haglund, 1975; Righetti, Drysdale
1976): (1) электрофоретическая миграция амфолитов-носителей в
изоэлектрическом состоянии; (2) электроэндосмос; (3) образование зоны
чистой воды на нейтральном участке градиента pH; (4) фокусирование воды
(которую можно считать амфоли-том), приводящее к ее накоплению в
нейтральной области градиента и последующему оттоку к периферийным
участкам геля;
(5) исходная недостаточность некоторых амфолитов или их постепенная
деструкция в ходе ИЭФ; (6) постепенное накопление или потеря амфолинами
какого-либо заряженного комплексообразующего компонента; (7) диффузия
амфолинов из геля и (или) электролитов в гель. Некоторые гипотезы
получили экспериментальное подтверждение в работах Fawcett, 1975d, и
Baumann, Chrambach, 1975. Кроме того, были выдвинуты гипотезы о
взаимодействии между амфолитами, а также о наличии в смеси -"плохих"
амфолитов, которые также могут быть причиной катодного дрейфа (Gianazza
et al., 1979; Arosio et al., 1978). В работе Delincee, 1980,
утверждается, что катодный дрейф обусловлен электроэндосмосом и
поглощением СОг из воздуха на катодном участке геля. Фундаментальный
обзор литературных данных по этому вопросу содержится в публикации Rilbe,
1977. Автор приходит к следующему выводу: "В большинстве случаев
дестабилизацию градиента можно объяснить электроосмотиче-ским течением
воды, а также транспортом связанной (гидрата-ционной) воды и вторичными
эффектами". На сегодняшний день наиболее общепринятой можно считать
концепцию, выдвинутую группой Крамбаха (Nguyen, Chrambach, 1975, 1977а-с;
Ап der Laan, Chrambach, 1980). Авторам удавалось подавить ка-
314
Глава 4
тодный дрейф, постепенно повышая pH в анолите (т. е. фактически снижая
концентрацию протонов у анода). Это согласуется с результатами
компьютерного моделирования градиента рн, которые указывают на то, что
стабильность градиента может зависеть от баланса между подвижностями и
концентрациями протонов и гидроксил-ионов, мигрирующих в противоположных
направлениях (Murel et al., 1979). Другими словами, согласно
вышеупомянутрй концепции, "протонное облако" движется от анода к катоду
быстрее, чем встречное "гидроксильное облако",.что в итоге приводит к
возникновению дрейфа по> направлению к катоду. Таким образом, по этой
гипотезе при выравнивании величин (молярность Н+) X (подвижность Н+) и
(молярность ОН-) X (подвижность ОН-) катодный дрейф должен полностью
прекратиться. Однако в действительности этого, по-видимому, не происходит
(Delincee, 1980). Ввиду того что предлагавшиеся ранее подходы не давали
удовлетворительных результатов, мы попытались найти более эффективное
средство избавления от катодного дрейфа. Нам удалось показать, что
полиакриламидная матрица действительно несет отрицательные заряды,
образовавшиеся в результате: (а) включения в гель примесей акриловой
кислоты, (б) ковалентного включения в матрицу остатков инициаторов
полимеризации (персульфата или рибофлавин-5'-фосфата) в виде концевых
групп полиакриламидных цепей и (в) гидролиза амидных груйп остатков
акриламида в слое геля, лежащем под катодной полоской фильтровальной
бумаги (Righetti, Macelloni, 1982). Мы пришли к выводу, что единственный
эффективный способ подавления дестабилизации градиента при ИЭФ - это
получение "сбалансированных матриц", т. е. ковалентное включение
третичных или четвертичных аминогрупп в количествах, компенсирующих
суммарный отрицательный заряд матрицы. Для этого мы использовали 3-
диметиламинопропилметакриламид (ДМАПМА) или
метакриламидопропилтриметиламмонийхлорид (МАПТАХ)" структурные формулы
которых приведены ниже:
СНз
сн2=с-с-т-сн2-сн2-сн>-н (сн3)2 о
ДМАПМА
. СНз
СН2=С-С-NH-СН2-СН2-СН2-Ы*(СНз)зСГ
о
МАПТАХ
Общие экспериментальные аспекты
315
Рис. 4л *х. Влияние основания (третичного амина) на катодный дрейф.
Полимеризация геля осуществлялась как в отсутствие (контроль), так и в
присутствии 3-диметиламинопропилметакриламида (ДМАПМА) в диапазоне
концентраций от 0,294 до 2,96 мкМ. Характерно, что при концентрациях
ДМАПМА выше эквивалентной (т. е. выше 1,20 мкМ) сфокусированные
гемоглобиновые зоны начинают смещаться к аноду (обратный "анодный>
дрейф). ИЭФ проводилось при 10°С в геле толщиной 360 мкм с Т=6%, СбИс=4%,
содержащем 2% амфолинов pH 3,5-10. Префокусирование - 20 мин,
фокусирование нормального гемоглобина взрослого человека - 1 ч. Отсчет
времени на оси. абсцисс приведенного графика начинается по истечении
указанных 80 мин.. Катодное (или анодное) смещение зон определяли при
постоянном значении напряжения 1000 В (100 В/см). (Righetti, Macelloni,
1982.)
Введение постепенно увеличивающихся количеств ДМАПМА в гель вызывает
