Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
щелочной области значений pH, происходит агрегация и преципитация зеинов,
даже несмотря на присутствие 6М мочевины в геле и образце. Таким образом,
в данном случае достоверные результаты можно получить при внесении
образцов только со стороны анода.
4.8. Источники питания
Со времени появления электрофоретических методов такие •факторы, как
природа поддерживающей среды, буферные системы, конструкция
электрофоретических ячеек и методы охлаждения, подвергались существенным
изменениям. В то же время источникам электрического питания уделялось
совсем мало внимания. Типичные источники питания различались между собой
только по величине предельной мощности и по режиму стабилизации -
"постоянный ток" или "постоянное напряжение".
Не так давно появилось второе поколение источников питания, которые могут
работать как в режиме стабилизации по току, так и в режиме стабилизации
по напряжению, а также автоматически переключаться с одного режима на
другой. С появлением ИЭФ возникла необходимость в создании третьего
поколения источников со стабилизацией по мощности. Поскольку повышение
разности потенциалов при ИЭФ способствует увеличению скорости миграции
белков к положению равновесия и образованию узких сфокусированных зон,
разумно проводить процесс при максимальном напряжении, но не допуская
избыточного выделения тепла (которое пропорционально квадрату
приложенного напряжения). Предельно допустимая величина электрической
мощности, которую можно считать оптимальной (Schaffer, Johnson, 1973),
зависит от электропроводности системы и от эффективности рассеяния
джоулева тепла. Последнюю можно оценить, помещая в разделительную колонку
термический зонд. После того как для данной системы установлена оп-
312
Глава 4
тимальная мощность, весь процесс фокусирования можно проводить в
изотермических условиях.
В работе Schaffer, Johnson, 1973, была предложена конструкция регулятора,
с помощью которого обычный источник постоянного тока можно преобразовать
в источник питания со стабилизацией по мощности. Был описан также
источник постоянной мощности с предельными значениями электрических
параметров 3000 В, 300 мА и 300 Вт, сделанный на основе источника
постоянного напряжения, к которому подключался регулятор мощности,
подающий сигнал на реверсивный синхронный движок (5 об./мин),
используемый в качестве сервомотора (Soder-holm, Lidstrom, 1975).
В настоящее время целый ряд фирм (в частности, LKB, Pharmacia, Bio Rad)
поставляет источники постоянной мощности, обеспечивающие напряжение до
3000 В, силу тока до 200 мА, мощность до 150 Вт и, таким образом,
удовлетворяющие требованиям практически любой системы ИЭФ. С появлением
источников постоянной мощности стало возможным проведение
высокоскоростного ИЭФ за счет использования максимального напряжения в
условиях контролируемого выделения тепла. Например, как уже упоминалось
(см. разд. 2.1.1.), при фокусировании на колонке с использованием
источников постоянной мощности равновесие достигается за 15-20 ч при
максимальной мощности 15 и 30 Вт и максимальном напряжении 1600 и 2000 В
в случае колонок LKB 8100-1 и LKB 8100-2 соответственно. В этих условиях
температура в колонке была постоянна и лишь на несколько градусов
превышала температуру охлаждающей жидкости, что контролировалось с
помощью игольчатых термисторов, установленных на различных уровнях в
колонках обоих типов. В работе Lundin et al., 1975, рекомендуется
проводить ИЭФ не дольше 20 ч, чтобы избежать искажения и даже разрушения
градиента pH, которые могут происходить при очень продолжительном
фокусировании. При ИЭФ в тонком слое прикладываемую электрическую
мощность можно повышать до 20-25 Вт, не опасаясь искажения градиента pH
или тепловой денатурации белков. При этом во избежание значительного
катодного дрейфа фокусирование не должно продолжаться более 2 ч.
4.9. Катодный дрейф
Уже в самых первых экспериментах по ИЭФ в геле стало ясно, что
рассматриваемое в теории метода равновесное состояние (Svensson, 1961,
1962а,b) со стационарным распределением амфолитов-носителей и белковых
зон быстро подвергается искажению, которое проявляется в смещении
образцов и амфо-
Общие экспериментальные аспекты
313
линов преимущественно к катоду. Такая дестабилизация градиента pH
получила название "эффект плато" (Finlayson, ¦Chrambach, 1971; Chrambach
et al., 1973) в связи с тем, что ¦она сопровождается образованием более
пологого участка в центральной области градиента. Другое название -
"катодный дрейф" (Righetti, Drysdale, 1971, 1973) - отражает основное
направление смещения зон. Весьма наглядной иллюстрацией этого явления
может служить серия картин разделения, полученная в процессе 8-часового
ИЭФ гемоглобинов, которая приведена в публикации Davies, 1975. Катодный
дрейф наблюдается и в том случае, когда вместо амфолинов используют
другие буферные компоненты (Nguyen, Chrambach, 1976) или когда в качестве
электродных растворов вместо сильных кислот и оснований используют
