Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
параметры можно изменять одновременно или по отдельности, в зависимости
от конкретной
36
Глава 1
задачи. Например, недавно было описано ИЭФ в трубках полиакриламидного
геля длиной 60 см (Rapaport, 1980). Вместимость по числу пиков и
разрешающая способность в этом опыте оказались заметно выше, чем при ИЭФ
в гелях обычной длины (10-12 см). Однако работа с подобными длинными
тонкими цилиндрическими гелями - полимеризация, окрашивание, отмывание
фона и т. п. - несомненно значительно усложняется.
1.5.9. Пре&ельная загрузка белковой зоны
В работе Rilbe, Pettersson, 1975, ограничение, накладываемое на
содержание белка в зоне при ИЭФ, выражалось следующим неравенством:
m< 5qo2(dc/dx), (27)
где q - площадь поперечного сечения разделительной колонки, о -
расстояние до точек перегиба на кривой гауссова распределения
концентрации белка в зоне, dc/dx - градиент концентрации сахарозы по
длине колонки. Если ввести дополнительно параметры: V - объем колонки, Н
- высоту колонки иг - ширину зоны, которую мы принимаем равной 2о в
относительных единицах длины колонки, т. е.
г = 2а/Я и о = rtf/2, (28)
то неравенство (27) можно переписать в виде
т < 1,251/Яг2 (dc/dx). (29)
Допустив, что концентрация сахарозы растет линейно, напри-, мер, от 0 до
0,5 г/см3, мо^но выразить dc/dx в численном виде:
dc/dx = Г/,см3- (30>
Подставив это значение в неравенство (29), получим
т < 0,625W2 (г/см3). (31)
Для колонки объемом 100 см3
т < 62,5г2 грамм. (32)
Таким образом, максимально допустимая загрузка белковой зоны растет
пропорционально квадрату ширины зоны. Так, в случае колонки высотой 25 см
из выражения (32) получаем, что для зоны шириной 1 мм загрузка должна
быть не более 1 мг. Но если в той же самой колонке ширина зоны достигает
1/10 полной длины пути, то содержание белка в этой зоне может быть
увеличено до 625 мг. При увеличении ширины зоны еще в 2 раза загрузку
можно довести до 2,5 г белка.
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ
37
Объединив уравнения (20), (17), (23) и (27), можно связать предельную
загрузку белковой зоны с разрешающей способностью:
^ 45я?>2 (dc/dx) /Ооч
т ^ ?* (Др1)2 [du/d (pH)]2 • ^ ^
Следовательно, рабочая емкость колонки растет пропорционально квадрату
разрешающей способности для данного набора белковых компонентов. Это
означает, что подбор градиента pH, обеспечивающего более высокую степень
очистки белковых фракций, одновременно позволяет увеличить содержание
белка, во фракциях. В этом смысле ИЭФ имеет очевидные преимущества по
сравнению с другими методами разделения, для которых высокий выход
вещества, как правило, достигается за счет ухудшения его очистки, и
наоборот.
До настоящего времени не было предложено ни одного уравнения для расчета
предельной загрузки белковых зон при ИЭФ в гелях. Экспериментальным путем
было найдено, что при ИЭФ в слое сефадекса максимальная загрузка по белку
достигает 10-12 мг/мл (Radola, 1975). В этих опытах загрузка определялась
количеством белка (в мг), содержащегося в 1 мл суспензии сефадекса,
непосредственно используемой для приготовления слоя. В слое
гранулированного геля размером 10X200X400 мм (общий объем 800 мл) в
градиенте pH 3-10 за один опыт удавалось успешно фракционировать белки из
10 г проназы Е. По качеству разделения данная система не уступала
аналитическим вариантам ИЭФ. При такой загрузке полупрозрачные зоны
сфокусированных белков видны в слое геля невооруженным глазом.
Приведенная выше оценка величины предельной загрузки получена при ИЭФ в
широком градиенте pH (3-10). Теоретически при работе в более узких
градиентах pH содержание белка может быть значительно увеличено [см,
неравенство (33)]. Таким образом, одно из важнейших преимуществ, которое
дает использование геля в качестве поддерживающей среды для ИЭФ,
заключается в значительной стабилизации белковых зон. Предельно
допустимая загрузка при ИЭФ зависит, конечно, и от ряда других факторов -
от числа разделяемых белков, от их растворимости в изоточке и т. д. В
работе Chrambach, 1980, приведены эмпирические оценки величин
максимальной загрузки для различных электрофоретических методов. Для
электрофореза (ЭФ) в полиакриламидном геле предельно допустимое
содержание белка в зоне - около 0,1 мг/см. Для ИЭФ эта величина выше на
1-2 порядка, а для изотахофореза (ИТФ) - на 2-3 порядка. Таким образом,
предельно допустимая загрузка белковой зоны при ИЭФ находится в диапазоне
1 -10 мг/см, при ИТФ - в диапазоне 10-100 мг/см.
38
Глав& 1
Концентрация белка в зоне при фокусировании едва ли может превышать 100
мг/мл. На участке с очень высокой концентрацией белка напряжение может
возрасти настолько сильно, что выделяющееся тепло вызовет денатурацию
белка. Рост напряжения на таком участке будет вызван падением
электропроводности, происходящим, вероятно, вследствие того, что ионы
буфера и молекулы воды оказываются в значительной степени
"иммобилизованы" - связаны с белком.
1.5.10. Условия образования плавного градиента pH
