Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 129

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 123 124 125 126 127 128 < 129 > 130 131 132 133 134 135 .. 171 >> Следующая

остатков персульфата, присутствующих в геле, такой восстановительный
процесс представляется весьма неожиданным. В работе Funatsu et al., 1973,
сообщалось о частичной утрате глутаминовой кислоты при ИЭФ
восстановленной формы рицина D. Авторы полагают, что это обусловлено
присутствием в препарате примесных протеиназ или же тем, что одна из двух
полипептидных цепей рицина D сама по себе является протеиназой. О
частичном расщеплении белков под действием эндогенных гидролаз при ИЭФ
кислых лизосомных гидролитических ферментов (кислой фосфатазы,
арилфосфатазы, p-глюкуронидазы, р-галактозидазы и p-N-аце-
тилгексозаминидазы) сообщалось в работе Needleman et al., 1975.
Расщепление удается частично подавить, добавляя в колонку при ИЭФ 0,1%-
ную нитрофенилоксамовую кислоту -ингибитор лизосомных нейраминидазы и
катепсина D.
По-видимому, наиболее дискуссионным остается вопрос о том, может ли
связывание с амфолитами быть причиной арте-фактной микрогетерогенности
белков. Окажись это. так, под сомнение пришлось бы поставить все данные о
множественных формах белков, которые во многих случаях удается обнаружить
с помощью ИЭФ и не удается обнаружить другими методами. В качестве
примера можно упомянуть о дискуссии, связанной с микрогетерогенностью
бычьего сывороточного альбумина (БСА). Надо все же признать, что случай с
БСА не совсем типичен, поскольку этот белок, как известно, обладает
сродством ко множеству различных лигандов (Steinhardt et al., 1972). В
работе Kaplan, Foster, 1971, приведены данные о том, что более кис-
310
Глава 4
лый компонент, обнаруживаемый при ИЭФ БСА в градиенте pH 4-6, в
действительности представляет собой прочный комплекс между альбумином и
каким-то минорным или примесным компонентом в смеси амфолитов.
Аналогичные свидетельства в пользу образования комплекса между БСА и
(14С)-мечеными амфолитами-носителями были представлены в работе Wallevik,
1973. С другой стороны, эти выводы не нашли подтверждения в опытах по
фокусированию БСА в присутствии 6М мочевины (Salaman, Williamson, 1971;
Spencer, King, 1971). По сути дела, авторы двух последних цитированных
публикаций отвергают возможность артефактного возникновения
микрогетерогенности БСА. В другом случае образование комплекса амфолит-
белок было отмечено при работе с кислым белковым компонентом! шерсти,
отличающимся низким содержанием серы (Frater, 1970). И все же можно
отметить, что на сегодняшний день свидетельства в пользу образования
прочных комплексов между амфоли-тами и белками немногочисленны, более
того, налицо целый ряд данных, достаточно убедительно отвергающих
возможность подобного комплексообразования. Так, при работе с гормоном
роста человека и овечьим пролактином в присутствии [ИС] -меченных
амфолинов удалось достоверно продемонстрировать отсутствие взаимодействия
между белками и амфолитами (Baumann, Chrambach, 1975а). Было установлено,
что . связывания белков с избытком амфолинов практически не происходит, а
уровень связывания амфолинов с избытком белка во всяком случае ниже
предела чувствительности метода, т. е. менее 0,2 моля амфолинов на 1 моль
белка. Аналогичные результаты были получены при работе с белками
сыворотки и некоторыми очищенными белками (альбумином, ферритином, р-
глюкуронида-зой) (Dean, Messer, 1975). Таким образом, в свете последних
данных представляется, что появление артефактов при ИЭФ за счет
взаимодействий амфолит-белок - это по меньшей мере крайне редкое событие.
При ИЭФ часто приходится сталкиваться с таким явлением, как "кажущаяся"
модификация белков, в частности при неблагоприятных условиях среды (pH
и/или ионная сила) в зоне внесения образца. Например, в работе Wadstrom;
Smyth, 1975b, было обнаружено, что белки из экстракта цитоплазмы бактерий
подвержены сильной адсорбции на "аппликаторе" при внесении образца со
стороны катода. Адсорбции удается избежать, если вносить образец со
стороны анода. Свести адсорбцию к минимуму обычно удается при введении в
гель и в "аппликатор" 4М мочевины. Присутствие в грубых экстрактах
значительной примеси нуклеиновых кислот тоже часто приводит к искажению
картины разделения и различиям в характере ИЭФ "анодных" и "катодных"
образцов. Этого, как правило, удается избежать
Общие экспериментальные аспекты
311
¦с помощью предварительной обработки экстрактов ДНКазой (Wadstrom, Smyth,
1975b).
Иногда оказывается, что ввиду индивидуальных особенностей образца для
получения адекватной картины ИЭФ его можно вносить только со стороны
одного из электродов. Так, при ИЭФ зеинов из маиса, внесенных со стороны
анода, наблюдалась высокая гетерогенность. В то же время при внесении
образцов со стороны катода не удавалось обнаружить практически ни одной
зоны (Soave et al., 1975). То же самое имело место даже при ИЭФ в 6М
мочевине или при нанесении образцов в виде свободного раствора без
носителя в лунки или непосредственно на поверхность геля. В конце концов
было установлено, что при нанесении образцов вблизи катода, т. е. в
Предыдущая << 1 .. 123 124 125 126 127 128 < 129 > 130 131 132 133 134 135 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed