Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
множество диссоциирующих функциональных групп, характеризуются одним
суммарным значением р/С.
Из рис. 1.7 видно, что, когда s стремится к предельному значению, т. е. к
1 (logs=0), переменные сп, bi и Др/С также стремятся к своим предельным
значениям: к максимальной степени ионизации <Zi=0,5, максимальной
буферной емкости &i = 2 и минимальному значению Др/С=0,6 соответственно.
При Ар/(<0,6 величины р/С/ и рКъ уже по существу не отвечают двум
независимым равновесным протолитическим процессам, а являются своего рода
"гибридными" константами диссоциации (Maclnnes, 1939)-.
log s
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ
31
/.5.5. Электропроводность в изопротонном состоянии
Для того чтобы быть "хорошим" амфолитом-носителем, соединение должно
непременно обладать хорошей электропроводностью при рН = р1. На участках
с низкой электропроводностью* не только происходит локальный перегрев, на
них теряется значительная часть общего падения напряжения. Это приводит к
ослаблению поля и соответственно к уменьшению разрешения на других
участках градиента.
Степень ионизации бивалентного амфолита может быть записана как
?амф+ + Самф- /riV
а - * (У/
^амф
где СаМф+ - молярная концентрация катионной формы, СаМф-- молярная
концентрация анионной формы и Самф - общая молярная концентрация амфолита
в виде ионов и недиссоцииро-ванных молекул. Пренебрегая коэффициентами
активности, и" закона действующих масс можно вывести следующие уравнения:
СамФ+ = Самфо(10Р^-РН), (10>
Самф. = Самфо(10РН-Р^), (11)
где СаМф0 - суммарная молярность цвиттерионной и недиссо-циированной
форм.
Общая молярная концентрация амфолита равна
+мф ^амф+ + +мф_ I ^амфо* 2)
Избавляясь в уравнениях (10) и (11) от СаМф0, после преобразования
получаем
Са"ф/Самф+ = 1 + Юрн-р/С1+102-(рн-р1), (13>
Самф/Самф- = 1+10Р^-РН+ 102 (PI-PH). (14>.
Для бивалентного амфолита значения рК (принимаем, что p/Ci<p/C2) и pi
связаны соотношением
р1 = _Р^ + р^.. (15),
Подставляя соответствующие выражения из (13), (14) и (15) в формулу (9),
получаем для степени ионизации амфолита а изоэлектрическом состоянии (рН
= р1)
а - 2 + iopI_p/Cl'
Максимальная электропроводность соответствует максимальному значению
а=1/2 при минимальном значении разности
S2 Глава 1
Рис. 1.8. Кривые титрования глутаминовой кислоты, глицина, гистидина и
лизина. Три аминокислоты из этого набора, обладающие четкими изоион-ными
точками (разность pi-p/Ci мала), являются достаточно эффективными
амфолнтами-носителями. В то же время глицин, который находится в
изоэлектрическом состоянии в широком диапазоне pH, можно считать ^0 2
4 6 8 10 12 "плохим* ' а мфолитом-носителем.
(Svensson, 1962а.)
pH
pi-p/Ct = log2 (Svensson, 1962a; Rilbe, 1971), т. e. хорошей
электропроводностью обладают амфолиты с малыми значениями pi-р/Сь
Аналогичная закономерность наблюдается и для буферной емкости амфолитов.
Таким образом, значение параметра ,(pl-p/Ci) является наиболее
существенным критерием три выборе хороших амфолитов-носителей.
Как видно из рис. 1.8, глицин находится в изоэлектрическом •состоянии в
широком диапазоне pH, от 4 до 8 (Др/(=7,4, и степень ионизации в
изопротонном состоянии а = 0,00038), т. е яв-.ляется плохим амфолитом-
носителем. В то же время гистидин, лизин и глутаминовая кислота обладают
четкими изоэлектриче-•скими точками (разность pi-p/Ci мала) и
соответственно проявляют свойства хороших амфолитов-носителей.
Буферная емкость и электропроводность в изоэлектрическом •состоянии
всегда взаимосвязаны. Это две важнейшие характе-¦ристики соединений,
которые могут быть использованы в качестве амфолитов-носителей для ИЭФ
(Svensson, 1962 а; см. также разд. 1.1).
Л.5.6. Принцип монотонного изменения pH
Естественный градиент pH, формируемый непосредственно электрическим
током, характеризуется монотонным возрастанием pH на всем пути от анода к
катоду (Svensson, 1967). Обра-лцение градиента в какой-либо точке между
электродами несов-
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ
33
местимо с представлением о стационарности. Это означает, что при
стационарном электролизе полное разделение двух амфолитов возможно лишь
тогда, когда в системе присутствует третий амфолит с промежуточным
значением pi. Так, для полного разделения Asp (pi 2,8) и Glu (pi 3,2)
между зонами этих амфолитов должна располагаться зона чистой воды (pi 7),
что противоречит принципу монотонности pH. Таким образом, в отсутствие
промежуточного амфолита гауссовы распределения этих аминокислот в
стационарном состоянии будут перекрываться.
В идеальном случае амфолиты для ИЭФ должны быть равномерно распределены
по всему диапазону pH. Для предотвращения образования зоны чистой воды
особенно важно располагать соответствующими амфолитами для нейтральной
области pH. Образование зоны чистой воды в фокусировочной колонке опасно
в первую очередь из-за локального разогрева. Расчетная электропроводность
воды (при 0°С) составляет
Xw= 1,8-Ю-s Ом'1 см'1.
Напряженность поля в колонке равна
