Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
присутствии непрерывного градиента концентрации мочевины. (Hobart, 1975.)
текать скачкообразно, при некоторой критической концентрации мочевины
(рис. 3,29,6), или плавно, в широком диапазоне концентраций (рис.
3.29,в). Химическая модификация, например частичное ацетилирование
одноцепочечных (или ковалентно связанных) структур, будет проявляться в
образований набора зон, параллельных друг другу вдоль всего градиента
мочевины (рис. 3.29,г). В случае белка, состоящего из субъединиц,
соединенных нековалентными связями, одна полоса нативного белка при
повышении концентрации мочевины расщепляется на несколько полос,
соответствующих свободным субъединицам (рис. 3.29,д). При фокусировании
изоферментов, представляющих собой статистический набор комбинаций
нескольких типов субъединиц.
17-1488
Глава 3
(например, двух типов субъединиц лактатдегидрогеназы), переход в область
повышенных концентраций мочевины сопровождается появлением диффузных
сливающихся полос вместо характерного набора зон. Эти диффузные полосы
при дальнейшем повышении концентрации мочевины трансформируются в
дискретные зоны, соответствующие субъединицам (рис. 3.29,е). Если белок
состоит из нескольких идентичных субъединиц, то его изоэлектрическая
кривая денатурации окажется неотличимой от кривых, соответствующих
денатурации ковалентных структур (рис. 3.29,ж). Различия между,
субъединицами можно выявить с помощью химической модификации (например,
частичного ацетилирования), сопровождающейся изменениями заряда. В этом
случае дискретные зоны искусственно полученных "изоферментов" при
переходе в область денатурации будут трансформироваться с образованием
сложной картины разделения, подобной той, которая показана на рис.
3.29,е.
К сожалению, работа Hobart, 1975, которая мне представляется одной из
самых изысканных в области изучения белковых структур с помощью ИЭФ,
осталась почти не замеченной в научном мире. В то же время большинство
сделанных автором предположений нашли подтверждение в прекрасной работе
Creighton 1979, посвященной исследованию денатурации белков при
электрофоретическом фракционировании в поперечном градиенте концентрации
мочевины.
3.4.6. ИЭФ - электрофорез в ДСС-Na
Этот метод является наиболее популярным, поскольку с его помощью лучше
всего удается решить основную задачу картирования белков - получить
максимально равномерное распределение пятен на поверхности геля второго
направления. Впервые метод двумерного разделения по заряду, а затем по
массе был предложен еще в работах Barrett, Gould, 1973а, и McGilli-vray,
Rickwood, 1974. Однако в работе O'Farrell, 1975, был описан простой
способ приготовления градиентного геля с ДДС-Na и сборки формы для
осуществления второй стадии фракционирования. Используя в качестве метода
детектирования радиоавтографию, автору удалось зарегистрировать более
тысячи различных белковых пятен в геле второго направления. Только с
появлением этой работы данный способ двумерного фракционирования начал
приобретать широкую популярность. Первое время при двумерном разделении
стадия ИЭФ всегда предшествовала стадии электрофореза в ДДС-Na
(O'Farrell, 1975; Yeoman et al., 1974; Ames, Nikaido, 1976), поскольку
считалось, что присутствие анионного детергента (ДДС-Na) при ИЭФ вызвало
бы искажение градиента pH. Однако вскоре стало ясно, что белки,
Аналитическое ИЭФ
259
обработанные ДДС-Na, можно подвергать ИЭФ без заметного искажения
процесса фракционирования (Miller, Elgin, 1974; Danno, 1977). Недавно
были описаны еще две методики, основанные на обратной последовательности
стадий, - электрофорез в ДДС-Na-ИЭФ. Введение такой последовательности
продиктовано вполне определенными экспериментальными потребностями. Так,
кипячение в ДДС-Na является очень удобным ¦способом получения клеточных
экстрактов, поскольку оно вызывает практически полную солюбилизацию
связанных с мембранами белков и одновременно снижает вероятность
модификации клеточных белков киназами, протеиназами и другими эндогенными
ферментами. В одном из таких методов полоску, вырезанную из геля после
электрофореза в ДДС-Na, накладывают на гель для ИЭФ, содержащий 8,5М
мочевину и 2,5%-ный нонидет NP-40 (Tuszynski et al., 1979). Совместное
действие мочевины и неионного детергента в геле приводит к расщеплению
комплекса белок-ДДС-Na. Наилучшие результаты были получены при
концентрации детергента в геле 2,5-3,5%; при содержании NP-40 ниже 2 или
выше 4% наблюдалось ухудшение разделения. В другом варианте (Siemankowski
et al., 1978) гель после электрофореза в ДДС-Na быстро обрабатывали
суспензией 1%-ной ДЭАЭ-целлюлозы в (30 мМ трис-0,225 М глицин) -буфере,
pH 8,6, содержащем 9М мочевину, 5 мМ аскорбиновую кислоту, 0,2 мМ ЭДТА,
0,12%-ный меркаптоэтанол и 10%-ный глицерин. Каждый из компонентов
суспензии играет определенную роль: мочевина способствует диссоциации
комплекса белок-детергент и препятствует агрегации белков, ДЭАЭ-целлюлоза
