Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
отрезают и отбрасывают (рис. 3.28,А,Б). Затем гель накладывают на
трафарет и с помощью фиксированного лезвия и скальпеля разрезают на
полоски (рис. 3.28,5), соответствующие трекам фокусирования каждого из
образцов. После этого с помощью гибкого лезвия каждую полоску можно легко
отделить и переложить на поверх-
6
CD
Рис. 3.28. Процедура наложения полоски геля при подготовке к проведению
второй стадии перекрестного ИЭФ-иммуноэлектрофореза. От пластины ПААГ
отрезают полоску, содержащую сфокусированные белки, переворачивают и
накладывают на поверхность пластины агарозного геля второго направления
(подробности см. в тексте). (Smyth et al., 1977.)
Аналитическое ИЭФ
253-
д % Е
ж 3
ность агарозного геля второго направления. Следует обратить внимание на
то, чтобы полоска геля прилегала к агарозному гелю той поверхностью, на
которую наносились фокусируемые-образцы. Данный метод позволяет получать
хорошо воспроизводимые неискаженные кривые иммунопреципитации (Solder-
holm, Smyth, 1975). В настоящее время метод сильно упростился за счет
применения полиэфирных подложек для заливки гелей (разд. 3.2.12), и
теперь разрезание геля на полоски и перенесение полосок на агарозный гель
не составляет практически никакого труда (разд. 3.4.6). Более того, с
появлением агарозы типа IEF (разд. 3.2.4) проблема контакта между гелями
первого и второго направлений снимается, поскольку оба этапа
фракционирования можно проводить в одной и той же матрице.
Недавно был описан метод "множественных иммунных реплик" (Legocki, Verna,
1981), особенно эффективный в сочетании с двумерным фракционированием.
Белки, разделенные в двумерном геле, подвергают электрофоретическому
переносу на несколько листов нитроцеллюлозной пленки (с получением так
называемых частичных "вестерн-блотов"). Таким образом по/-
:254
Глава 3
лучают несколько идентичных реплик (обычно 2-3, а для наиболее
интенсивных белковых зон - 4 или 5 реплик). Каждую реплику можно
последовательно обработать серией различных антисывороток (тремя и
более), удаляя предшествующие антитела обработкой при pH 2,2. Комплексы
антиген-антитело выявляются с помощью белка А, меченного 1251. Этот метод
позволяет обнаруживать белки с использованием не менее чем девяти
различных антисывороток.
3.4.2. ИЭФ - электрофорез в геле
Этот подход сочетает разделение по заряду с разделением и по заряду, и по
размеру во втором направлении. В работе Dale, Latner, 1969, было впервые
показано, что такой метод ¦фракционирования позволяет зарегистрировать
количественные и качественные изменения при сравнении белковых карт
нормальной и патологической сыворотки. После ИЭФ в цилиндрическом ПААГ
столбик геля, содержащий сфокусированные белки, помещали на верхний торец
пластины геля второго направления, - в котором осуществлялось
электрофоретическое разделение белков. Электрофоретическая подвижность
белков и амфолитов при миграции в геле определяется соотношением заряда и
молекулярной массы. Амфолиты, таким образом, легко отделяются от белков,
в результате фракционирования которых образуется характерная белковая
карта. Для сохранения электрофореграммы пластину геля можно высушить на
подложке после окрашивания и вымачивания в 7%-ной желатине и 3%-ном
глицерине. На полученных таким образом белковых картах удавалось
идентифицировать многие известные компоненты сыворотки с применением
стандартов, а также различных вариантов гистохимического и
иммунологического детектирования (Dale, Latner, 1969). Разработанный
метод был успешно использован в клинике, в частности при почечных
синдромах, моно- и поликлональной гаммапатии, множественном склерозе,
IgG-миеломатозе, протеинурии (Latner, 1973), а также для определения
генетических вариантов гаптоглобина (Latner, Ames, 1975). Аналогичный
подход был также применен для анализа •белков из пшеничного зерна
(Wrigley, 1968b; Wrigley, Shepherd,
1973). При обычном электрофорезе в препарате пшеничного гли-адина
удавалось обнаружить около 20 различных компонентов и примерно столько же
компонентов при ИЭФ. При сочетании этих двух методов фракционирования
число разделяемых компонентов возрастало примерно вдвое. Двумерное
фракционирование такого же типа в работах Macko, Stegeman, 1969, и Ste-
geman et al., 1973, было использовано для "картирования" бел--кав
картофеля. Эти авторы также отметили, что при сочетании
Аналитическое ИЭФ
255
двух методов удается получить картину разделения более подробную и более
специфическую для каждой данной разновидности картофеля, чем в случае
проведения одномерного электрофореза или ИЭФ.
3.4.3. ИЭФ - электрофорез в градиентном геле
Использование ИЭФ и электрофореза в геле продемонстрировало широкие
возможности техники двумерного фракционирования для генетических и
таксономических исследований. Однако при традиционном гелевом
электрофорезе белки-t разделяются одновременно и по массе, и по заряду, а
в отдельных случаях эти два фактора противоположным образом сказываются
