Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг - Пташне М.
ISBN 5-03-000854-3
Скачать (прямая ссылка):
Приложение 2 Сильные и слабые взаимодействия
Взаимодействия компонентов переключателя генов фага X относятся к двум типам: сильные и слабые. Энергия ДНК-бел-
ковых взаимодействий составляет —10------15 ккал/моль, что
соответствует Кп примерно 10 10 М, а энергия белок-белко-вых взаимодействий примерно на порядок меньше и соответствует равновесным константам диссоциации порядка 10. Репрессор, связанный с 0R1, помогает другому репрессору связаться с 0R 2, а тот в свою очередь помогает полимеразе связаться с PRM и начать транскрипцию. Но в обоих случаях
эффект составляет величину ~ — 1------2 ккал/моль, что на
порядок меньше энергии прямых ДНК-белковых взаимодействий.
Одно из последствий этого различия состоит в том, что при исследованиях in vitro эффект такого рода слабых взаимодействий часто не обнаруживается. Например, если просто определять интенсивность транскрипции с Рш при высокой концентрации полимеразы, она оказывается максимальной и стимулирующее действие репрессора не выявляется. Возьмем другой пример. Если удалить 0R1 и 0R3, репрессор при высокой концентрации будет связываться с 0R 2, и сложится впечатление, что 0R1 не имеет отношения к этому связыванию. В обоих случаях вместо увеличения концентрации белка в экспериментах in vitro можно понизить концентрацию соли и таким образом увеличить константу связывания. Интерпретация подобных экспериментов осложняется тем, что внутриклеточные условия in vivo (концентрации взаимодействующих компонентов, ионная сила, pH и т.д.) в точности неизвестны.
Если при изучении той или иной регуляторной системы ставится задача выяснить роль всех важнейших компонентов, может оказаться полезным проверить полученные in vitro результаты в экспериментах in vivo, как это было сделано при изучении фага X.
Приложение 3
Единый механизм регуляции транскрипции у эукариот и прокариот
Известен ряд генов эукариот, которые отличаются от генов фага X следующим удивительным свойством: транскрипция каждого из этих генов активируется белком, который связывается на расстоянии нескольких сотен пар оснований от места инициации транскрипции. Такие гены найдены у человека, грызунов и дрожжей.
Рассмотрим в качестве примера дрожжевой ген GAL1-один из генов, обеспечивающих рост дрожжей на галактозе. Примерно за 250 пар оснований до этого гена расположен участок, который обозначается UASG (от англ. t/pstream Activating Sequence-последовательность, активирующая ген GAL и расположенная до него). Связавшись с UASG, белок GAL4 запускает транскрипцию, идущую с начальной точки гена GAL 1. Если поместить UASG за целых 600 пар оснований до другого дрожжевого гена, этот ген включится под действием GAL4. Как осуществляется такое дальнодействие? Следует ли нам использовать те данные, которые были получены при изучении фага X, или мы должны привлекать новые идеи?
При изучении фага X были выяснены два основополагающих молекулярных механизма, обеспечивающих действие белков-активаторов транскрипции. Первый из них описывает взаимодействие регуляторных белков с ДНК, второй-активацию транскрипции гена под действием регуляторного белка, связанного с ДНК. Мы утверждаем, что оба этих механизма приложимы к регуляции экспрессии генов у других организмов, в том числе у эукариот.
Во-первых, регуляторные'белки узнают специфические последовательности оснований в ДНК благодаря взаимодействию комплементарных поверхностей. В тех случаях, которые были подробно рассмотрены в этой книге, белки содержат выступающие а-спирали, которые располагаются в большом желобке ДНК и образуют специфические контакты с экспонированными химическими группами ДНК. Нам известно, как узнает ДНК еще один белок. В данном случае речь идет не о регуляторе транскрипции, а о ферменте, который расщепляет ДНК по строго определенным последовательностям. Этот
143
бактериальный белок Eco R1 содержит выступающие а-спирали, которые укладываются в большие желобки молекулы ДНК. В деталях механизм узнавания отличается от описанных нами примеров, но, как и в случае А,-репрессора, конформация белка в целом комплементарна конформации обычной двухцепочечной ДНК. Хотя при связывании этого белка конформация спирали несколько нарушается, никаких радикальных изменений не происходит.
Некоторые эукариотические регуляторные белки, в том числе GAL4, удалось выделить и показать, что они связываются in vitro со специфическими последовательностями ДНК. Хотя у нас нет полного представления о том, как эти белки взаимодействуют с ДНК, нет никаких оснований полагать, что они используют при этом какие-либо другие приспособления помимо структур, выступающих из белковой глобулы и комплементарных обычной двойной спирали ДНК. В тех случаях, когда удалось измерить сродство этих белков к их операторным участкам, оно оказалось сравнимым со сродством А,-по-добных регуляторных белков к их операторам. Аминокислотные последовательности некоторых белков (но не всех) позволяют предположить, что при узнавании они используют би-спиральный элемент, подобный таковому в белках фага X. В одном случае при связывании регуляторного белка генов теплового шока Drosophila он кооперативно связывается с двумя соседними участками ДНК. При этом энергетика связывания на удивление близка к связыванию А,-репрессора с 0R1 и 0R2, что, по-видимому, является простым совпадением. Еще один случай-активаторы транскрипции 5S-reHOB, кодирующих небольшую РНК Xenopus laevis. Здесь несколько белков, каждый из которых обладает примерно таким же сродством к ДНК, как и А,-репрессор, кооперативно связываются и образуют комплекс, который остается стабильным практически до бесконечности (см. работы [1, 2, 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22]).
