Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг - Пташне М.
ISBN 5-03-000854-3
Скачать (прямая ссылка):
[О] ^ К0Р[РТ]
[От] ~ XD[RT] '
136
Считается, что по крайней мере некоторые специфически связывающиеся с ДНК белки в бактериальной клетке большей частью связаны с ДНК неспецифическим образом, а не находятся в свободном виде в растворе. Этот вопрос трудно решить количественно, поскольку остается ряд неопределенностей: например, in vitro сродство репрессора к оператору и к неспецифической ДНК изменяется на несколько порядков при не очень больших изменениях температуры и ионной силы, близких к физиологическим значениям. При этом точные ионные условия внутри клетки нам неизвестны.
Увеличение специфичности
Представим теперь гипотетический репрессор с таким отношением сродства к специфическим и неспецифическим участкам ДНК, что при данной концентрации он заполняет оператор всего на 1%. Каким образом можно увеличить эффективность связывания до 99%?
Увеличение концентрации белка
Как мы уже отмечали, для этого понадобится увеличить концентрацию белка в 100 раз.
Повышение специфичности
Белок можно модифицировать таким образом, чтобы отношение эффективности специфического и неспецифического связывания увеличилось. Рассмотрим два подхода к решению этой задачи.
• Сродство к специфическим участкам увеличивается, а к неспецифическим остается прежним. В какой мере возможна такая модификация типичных репрессоров прокариот-неизвестно. Скорее всего какого-то результата удастся достичь, введя один-два дополнительных специфических контакта между узнающими участками белка и функциональными группами ДНК.
• Отношение эффективности специфического и неспецифического связывания увеличится и в том случае, если увеличить в равной степени число специфических и неспецифических контактов.
Пусть некий репрессор связывается с оператором с К0р = 10-10 М. а со случайными последовательностями ДНК-с KD = 10~4 М. Теперь удвоим размеры репрессора и оператора, так чтобы они образовывали вдвое больше специфических и неспецифических контактов. Константы связывания более крупного белка с операторными и неспецифическими участками ДНК будут в первом приближении составлять
137
К0р = Ю“20 М и Kd=10~8M. (Удвоение числа контактов означает, что удваивается энергия — AG; напомним, что К связано с AG экспоненциально: К = е_4С/Лг. При изменении AG на 2,8 ккал/моль К меняется в 100 раз.)
Обратите внимание, что, удвоив размеры репрессора и оператора, мы увеличили отношение эффективностей специфического и неспецифического связывания с 106 до 1012. Другими словами, величина KD/K0P возросла в 106 раз. Итак, наш анализ показывает, что более крупный репрессор работает гораздо эффективнее, чем небольшой по размеру. Однако теперь мы сталкиваемся с кинетической проблемой: абсолютное значение константы неспецифического связывания настолько велико, а неспецифических мест так много, что репрес-соры практически все время связаны с ними. В результате равновесие между специфическими и неспецифическим связыванием достигается слишком долго.
Суть кинетической проблемы состоит в том, что репрессор, связанный с участком с KD = 10“8 М, остается на этом участке около 0,1 с. Эта оценка основана на измерении скорости диссоциации комплексов различных репрессоров с операторами. Мы уже говорили, что в Е. coli имеется примерно 107 неспецифических участков. Даже если только 10% этих участков будет связано с репрессором, он будет оставаться на них более 25 ч, что примерно в 10 раз больше времени генерации типичной бактериальной клетки.
Итак, мы приходим к выводу, что наш гипотетический репрессор двойного размера не сможет найти свой оператор за время генерации. В состоянии равновесия репрессор действительно будет связан с оператором, но равновесие никогда не будет достигнуто.
Существует, по-видимому, и еще одна проблема, связанная с репрессором двойного размера. Величина константы диссоциации К0р = Ю-20 М означает, что, однажды связавшись с оператором, белок остается на нем практически до бесконечности. Никакой механизм индукции или любой другой клеточный процесс, для которого необходимо, чтобы комплекс ре-ирессора с оператором спонтанно диссоциировал, не сработает в течение сколько-нибудь разумного промежутка времени. Поскольку энергия связывания так велика, для удаления репрессора с оператора необходима радикальная перестройка конформации белка.
Использование кооперативности
Попытаемся ввести в систему кооперативность. Встроим еще один оператор рядом с первым, а репрессор сконструируем таким образом, чтобы его молекулы, связанные с этими операторами, взаимодействовали между собой.
138
10"9 Ю 8 Ю'1 Ю'6 ю"5
Концентрация репрессора, М
Рис А 1 Чтобы заполнить одиночные операторные участки на 990/о необходимо в 30 раз больше репрессора, чем для заполнения двойного оператора, с которым репрессор связывается кооперативно Ести продолжить приведенные кривые, то мы увидим что для заполнения на 99,9% потребуется уже в 100 раз ботьше репрессора При построении кривых предполагалось, что сродство репрессора к каждому операторному участку при независимом связывании составтяет — 10 ккал/моль и энергия взаимодействия между двумя связанными репрессорами в случае оператора, состоящего из двух участков, достигает — 2 ккат/моль Ести же представить себе систему из двух участков связывания, в которой энергия взаимодействия составляет — 5 ккал/ моль то по сравнению с первой системой количество репрессора, необходимое для заполнения 99 и 99,9% участков, будет еще в 40 и 100 раз ниже соответственно Модель с двумя участками, использованная в данном случае, примерно соответствует заполнению операторных участков 0„2 и 0R3 фага X (в отсутствие функционального 0R1), а модель с одним участком заполнению одиночного участка 0R3 (Кривая для модели с двумя участками построена для случая заполнения одного из них, но, поскольку участки заполняются практически одновременно, эго мало влияет на форму кривой ) Кривые были построены С Джонсоном (см работу Ackers et al, 1982)
