Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
137
механизмах их функционирования. Однозначная интерпретация имеющегося экспериментального материала, в частности, установление обусловленности функций белков структурной организацией их молекул, непременно требует привлечения соответствующих теорий и расчетных методов. Дальнейшее качественное совершенствование представления о структурной и структурно-функциональной организации белков немыслимо без теоретической молекулярной биологии -таков принципиальный итог развития рентгеновской кристаллографии белковых молекул.
При обсуждении рентгеноструктурных исследований в настоящей главе акцент сделан не на конкретных объектах анализа, а на впервые использованных методологических и технических усовершенствованиях, касающихся источников излучения, продолжительности измерений, фазовой проблемы и условий проведения эксперимента. Новшества такого рода представляют особый интерес, поскольку именно они приводят к получению ранее недоступной информации и, следовательно, ведут к интенсивному развитию морфологии белков.
4.1. СИНХРОТРОННОЕ ИЗЛУЧЕНИЕ
Самым существенным методологическим достижением рентгеноструктурного анализа последнего десятилетия, по-видимому, можно считать начавшееся применение в кристаллографии белков синхротронной радиации, значительно более мощной по сравнению с излучением традиционных источников. В первый период становления рентгеноструктурного анализа, 1960-1970-е годы, большинство трехмерных структур белков было расшифровано с использованием запаянных острофокусных трубок с медным анодом, имеющих характеристическую длину волны X (Ка) ~ 1,54 А и фокусное пятно примерно 8,0 х 0,4 мм. Интенсивность излучения таких трубок ограничивалась скоростью отвода тепла от анода и при малых кристаллах белков с большими элементарными ячейками не обеспечивала желаемого разрешения. В конце 1970-х годов появились трубки с вращающимся анодом и фокусом ~ 2,0 х 0,2 мм. Их яркость, оцениваемая потоком фотонов коллимированного рентгеновского пучка (109—Ю10 фотонов в с), была в несколько раз выше, чем у лучших запаянных трубок, а фокусировка пучка на заметно меньшую площадь позволяла получать дифракционные картины с более высоким разрешением и меньшей экспозицией. В настоящее время рентгеновские трубки с вращающимся анодом и никелевым или графитовым фильтрами применяются в анализе повсеместно.
В 1959 г. Л. Парратт предложил использовать в кристаллографии в качестве источника рентгеновского излучения синхротрон [488]. Заряженные частицы, двигаясь по кругу в синхротроне с релятивистскими скоростями в однородном магнитном поле, начинают испускать при торможении и искривлении траектории сплошной спектр электромагнитных волн в форме острого конусного пучка с углом
138
Рис. 1.38. Зависимость ин- /о"
тенсивности излучения N(X) синхротрона в г. Дейрсбэри от длины волны
N(X) — число фотонов/ (с. мрад. jj
А) в полосе шириной 0,1% для Е=2,0 ГэВ, В=1,2 тесла, 1=1,0 А и R=5.5 м ^ jg/2
JO,!
JOw
0,5 7,0 1,5 Z,0 J,S J,0 JJ
Длина &олны,к
расхождения ~ 0,018° и осью, совпадающей с мгновенным (тангенциальным) направлением движения. Коротковолновая часть спектра синхротронного (магнитотормозного) излучения (рис. 1.38) имеет широкий максимум в области, представляющей интерес для рентгеноструктурного анализа. Полихроматическая радиация синхротрона, в отличие от традиционных источников, может быть монохроматизирована на значительно большем участке длин волн и, следовательно, дать мощный поток рентгеновских лучей. У электронного синхротрона в г. Дейрсбэри (Великобритания) полезный поток фотонов N(\) по меньшей мере в 102-103 раз более интенсивен, чем у самых совершенных современных рентгеновских трубок с вращающимся медным анодом. Идея Парратта стала предметом серьезных дискуссий, однако, долгое время оставалась нереализованной. Сомнения вызывали как возможность фактического увеличения интенсивности дифракционных пучков, так и способность белковых кристаллов выдерживать интенсивное облучение [489]. Лишь в 1971 г. синхротронная радиация была применена в дифракционных исследованиях биологических объектов. Г. Розенбаум и соавт. [490, 491], изучая рассеяние рентгеновских лучей под малыми углами мышечных волокон, показали, что использованное ими излучение после моно-хроматизации и фокусировки на два порядка превосходит максимальную интенсивность коллимированного фильтрованного СиКа-излучения рентгеновской трубки и при этом не разрушает облучаемый объект. Использование синхротронной радиации в методе малоуглового рентгеновского рассеяния было предложено М.А. Мокульским и соавт. [492].
Вопрос о возможности применения синхротронного излучения в рентгеноструктурном анализе белковых монокристаллов впервые был рассмотрен в теоретическом плане Г. Уискоффом [493] и С. Харрисоном [494], а в экспериментальном Дж. Филлипсом и соавт. [495]. В последней работе получены четкие фотографии дифракционных рефлексов от радиации электронно-позитронного синхротрона, рассеивающейся плоскостями монокристаллов белковых молекул рубредок-сина, азурина, фактора роста нервных клеток и L-глутамин-аспара-гиназы. Некоторые условия эксперимента приведены в табл. 1.9. Авто-
