Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
Вопросы, касающиеся природы и механизма взаимодействия гистонов друг с другом и двойной спиралью ДНК, возникли задолго до привлечения к их рассмотрению рентгеноструктурного анализа. И хотя установление трехмерной структуры нуклеосомы окончательно не решило ни одного из них, ситуация в этой области претерпела качественное изменение. Стала известна морфология изучаемого объекта, и все вопросы о его функционировании перешли из натурфилософской категории в категорию строго научных. Что это означает, детально рассматривается в двух последующих томах настоящего издания.
112
Рис. 1.27. Вращение двойной спирали ДНК при её репликации
Структура N-концевого фрагмента ДНК-топоизомеразы I. При
репликации ДНК скорость полимеризации у бактерий и млекопитающих колеблется соответственно от 500 до 50 нуклеотидов в секунду. При этом на каждые 10 пар оснований новосинтезированной цепи родительская двойная спираль ДНК, чтобы не быть запутанной, должна совершать один полный оборот вокруг своей оси (рис. 1.27). Следовательно, для беспрепятственного передвижения репликационной вилки с наблюдаемой на опыте скоростью вся хромосома, находящаяся впереди вилки, должна совершать 50-55 об/с. Аналогичная "проблема кручения" возникает, очевидно, при транскрипции и рекомбинации ДНК. Во всех случаях она решается с помощью особых ферментов, ДНК-топо-изомераз, образующих в спиралях своего рода "шарниры".
ДНК-топоизомераза типа I расщепляет фосфодиэфирную связь в одной из цепей ДНК и ковалентно присоединяется, как правило, посредством боковой цепи тирозина к образовавшемуся свободному 5'-кон-цу. Обрыв цепи дает возможность двум половинам двойной спирали свободно вращаться вокруг фосфодиэфирной связи, находящейся напротив разрыва, и тем самым снимать накопившееся напряжение. Ковалентная связь белок-ДНК высокоэнергетична, а поэтому реакция ферментативного гидролиза фосфодиэфирной связи обратима и не требует участия АТР. После снятия напряжения разорванные концы цепи ДНК соединяются вновь. Таким образом, по своей функции ДНК-топоизомераза представляет собой нечто вроде "обратимой нуклеазы" или "обратимой ДНК-полимеразы". Впервые ДНК-топоизомераза была выделена из клеток Е. coli Дж. Уангом в 1971 г. [419]. До сих пор она остается наиболее широко изученным ферментом подсемейства ДНК-
113
топоизомераз типа I, к которому принадлежат открытые много лет спустя топоизомеразы III Е. coli [420] и S. cerevisiae [421, 422], а также обратимая гираза архебактерии Sulfolobus acidocaldarius [423, 424]. Помимо описан-ной реакции ферменты этого типа катализируют релаксацию неправильно закрученной линейной суперспирали ДНК, распутывание и замыкание колец единичной цепи ДНК, спаривание комплементарных колец и ряда других родственных операций. Общим для ДНК-топоизомераз типа I является механизм каталитического акта, протекающего без использования энергии АТР и непременно включающего стадию временного разрыва только одной цепи двойной спирали ДНК. Аналогичные по функции ферменты, расщепляющие, однако, не одну, а две фосфодиэфирные связи и ковалентно связывающиеся с обеими цепями двойной спирали, составляют подсемейство ДНК-топоизомераз типа П [425].
В 1994 г. X. Лима, Дж. Уанг и А. Мондрейгон опубликовали результаты рентгеноструктурного анализа пространственного строения N-концевого фрагмента ДНК-топоизомеразы IЕ. coli [426]. Трехмерная структура фрагмента полипептидной цепи из 553 аминокислотных остатков и молекулярной массы 67 кДа (целый белок 97 кДа) была определена с разрешением 2,2 А при расшифровке дифракционных картин, полученных при температуре кристаллов - 168° и использовании синхротронного излучения. Данная работа - это первое кристаллографическое исследование топоизомеразного объекта.
ДНК-топоизомераза I металлофермент, С-концевой фрагмент которого содержит три атома Zn(II) и три участка с двумя дисульфидными связями [427]. Каталитическая реакция расщепления нуклеотидной цепи ДНК включает трансэтерификацию между фосфодиэфирной связью субстрата и боковой цепью Туг-319 фермента [428]. В этой реакции не участвует С-концевой фрагмент белка с дисульфидными связями. Что касается атомов цинка, то они также не оказывают влияния на стадию расщепления фосфодиэфирной связи, однако необходимы для замыкания разорванной цепи после релаксации ДНК [429]. Поэтому исследованный в работе [426] фрагмент с молекулярной массой 67 кДа ДНК-топоизомеразы типа I может катализировать расщепление единичной нуклеотидной цепи, но не в состоянии восстановить целостность суперспирали ДНК. Его субстратная специфичность и кинетические характеристики такие же, как у нативного белка или белка, лишенного цинка [429,430].
Трехмерная структура N-концевого фрагмента представляет собой неправильный вытянутый тор с внешними размерами 67x43x86 А. Он образован четко отделенными друг от друга и хорошо наблюдаемыми четырьмя доменами I-IV (рис. 1.28). Вторичные структуры доменов приведены в табл. 1.8. В домен III входит каталитически важный остаток Туг-319. Активный центр ДНК-топоизомеразы I, образованный доменами I, III, показан на рис. 1.29.
