Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
Использование В.К. Антоновым и соавт. метода, основанного на
включении атома тяжелого кислорода молекулы Н2 О в продукты ферментативных реакций, сыграло, по-видимому, решающую роль в установлении типа каталитической реакции аспартатных протеиназ [378— 380]. Проведенные впервые В.К. Антоновым сопоставительные исследования гидролиза, катализируемого различными амидгидролазами, показали, что сериновые и цистеиновые протеиназы функционируют по ковалентному типу, а аспартатные и металлсодержащие протеиназы — по типу общего основного катализа. Этот вывод согласуется с наиболее однозначно трактуемыми результатами химических, кинетических и термодинамических исследований каталитических реакций эндопро-
84
теиназ. Он был подтвержден позднее данными рентгеноструктурного анализа ферментов, и в настоящее время является общепризнанным.
Структура аспартатной протеиназы HIV-1. Интерес к механизму действия аспартатных протеиназ особенно возрос в последнее время в связи с обнаружением ферментов этой группы у ретровирусов, вызывающих в организмах человека и животных такие болезни, как AIDS, некоторые виды лейкозов, сарком и онкоопухолей молочных желез. Самое важное здесь заключается в установлении того факта, что ставшие известными аспартатные протеиназы этих вирусов играют ключевую роль в их жизненных циклах. В клетке-хозяине они гидролизуют белки ядерных капсид, окружающих вирусные РНК, расщепляют полибелковые цепи на зрелые структурные белки и ферменты, участвующие в репликации ретровирусов. Вирусные протеиназы в состоянии также гидролизовать белки инфицированных клеток, нарушая тем самым целостность их структурно-функциональной организации. В то же время клеточные протеолитические ферменты не обладают способностью расщеплять вирусные протеиназы и выполнять их функции. Таким образом, в отсутствие протеиназ или при их ингибировании вирусы иммунодефицита человека (HIV-1, HIV-2) и обезьяны (SIV), а также опухолеродные вирусы не смогли бы приобретать инфекционные формы. По этой причине протеиназы ретровирусов стали объектами пристального внимания энзимологов и медиков.
Аспартатные протеиназы ретровирусов сразу же после их открытия начали интенсивно исследоваться и через 2—3 года стали одними из наиболее тщательно изученных ферментов. Основное внимание было уделено аспартатной протеиназе HIV-1, о структуре и функции которой сейчас известно, пожалуй, больше, чем о таком классическом объекте, как пепсин, открытом еще в 1836 г. Последовательность HTV-1 протеиназы состоит из 99 аминокислотных остатков, тогда как аспартатные протеиназы позвоночных и микроорганизмов содержат их более трехсот. В ней встречается фрагмент Asp—Thr— Gly, присутствующий в каждом домене у всех пепсиноподобных ферментов. JI. Пёрл и У. Тейлор предположили, что физиологически активная форма HIV-1 протеиназы включает две молекулы, ассоциированные посредством невалентных взаимодействий [381]. Я. Чанг и соавт. проверили это предположение экспериментально [382]. Методами генной инженерии была синтезирована полипептидная цепь из 203 аминокислотных остатков, составляющих две молекулы HIV-1 протеиназы, С- и N-концы которых соединены пентапептидным участком Gly—Gly—Ser—Ser—Gly. Такой валентно связанный димер в физиологических условиях спонтанно принимал конформацию нативного Димера и обладал идентичной с ним активностью. Этот вывод недавно нашел подтверждение в работе Т. Бхата и соавт., определивших трехмерную структуру аналогичным образом связанного димера протеиназы HIV-1 с разрешением 1,8 А [383]. При замене одного из двух каталитически важных остатков Asp-25 на Gly актив= ность пропадает. К тем же результатам привело исследование
85
Таблица 1.2
Расстояния (А) между атомами боковых цепей Asp-32 и Asp-215 (нумерация пепсина) в кристаллографических структурах аспартатных протеиназ
Фермент 81 81 82 82 С32---^lS 81 82
032---°2i5 °215 °32~1°215
Пепсин 2,8 5,8 5,1 4,4
Ренин 2,9 6,2 5,3 4,8
Пенициллопепсин 2,9 5,8 5,2 4,4
Эндотиопепсин 2,9 5,7 5,2 4,4
Ризопуспепсин 3,1 6,1 5,4 4,7
HIV-1 протеиназа 3,0 5,8 5,2 4,7
RVS-протеиназа 2,8 5,6 5,0 4,6
Фермент 82 81 СР _ d5 а а
°215 с32 215 32 ^15
Пепсин 4,8 7,4 6,7
Ренин 4,8 7,4 6,6
Пенициллопепсин 4,8 7,5 6,6
Эндотиопепсин 4,8 7,6 6,6
Ризопуспепсин 5,0 7,7 6,8
HIV-1 протеиназа 4,7 7,4 6,6
RVS-протеиназа 4,2 7,4 6,4
К. Диланни и соавт. валентно связанного димера HIV-1 протеиназы с дипептидным мостиком Gly—Gly и заменой Asp-25 на Asn и Glu [384].
А. Томасселли и соавт. определили константу диссоциации нативного димера HIV-1 протеиназы, которая оказалась равной 2 пМ [385]. Согласно Я. Чангу и соавт., ее величина составляет 50 пМ [382]. Несмотря на значительное расхождение найденных констант диссоциации, можно тем не менее полагать, что димеризация HIV-1 протеиназы происходит в нонамолярной области, т.е. при концентрации много ниже той, которая существует в вирусной частице. Исследование С. Силмей-ера и соавт. показало, что каталитическая активность HIV-1 протеиназы подавляется пепстатиновыми ингибиторами, что характерно для всех аспартатных протеиназ [386]. Там же отмечено, что замена в последовательности вирусной протеиназы остатка Asp-25 на Thr ведет к полной потере активности. Аналогичный эффект наблюдался при замене в последовательности HIV-1 протеиназы остатка Asp-25 на Asn [386, 387], Ala [388, 389], Туг и His [388]. Активность падает до нуля также у пепсина в случае подобного мутагенеза одного из его каталитических остатков Asp [390]. Таким образом, можно утверждать, что физиологически активной является димерная форма HIV-1 протеиназы, в которой каталитически важную роль играют оба остатка аспарагиновой кислоты (Aps-25 и Asp-125). Лишь эта форма обладает всеми отличительными признаками аспартатных протеиназ. Следовательно, димерная форма HIV-1 протеиназы, подобно пепсину, ренину, ризопус-
