Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
Кристаллографическая структура молекулы первого мембранного фермента, простагландин-Н2-синтазы (PGHS), была впервые установлена в 1994 г. Д. Пико и соавт. [261]. Белок катализирует два процесса на первой стадии биосинтеза простагландинов. Он инициирует и активирует циклооксидазную реакцию, по ходу которой арахидоновая кислота превращается в простагландин PGG2, и последующую пероксидазную реакцию, при которой PGG2 переходит в PGH2, быстро трансформирующийся в один из простаноидов. PGHS - интегральный мембранный белок, локализованный преимущественно в эндоплазмати-ческом ретикулуме. Его освобождение от мембраны проводится экстракцией солевым раствором и солюбилизацией неионным детергентом, в присутствии которого осуществляется также кристаллизация. В полученном образце белковые молекулы ассоциированы с флур-бипрофеном, нестероидным противовоспалительным препаратом, и
64
образуют димерные комплексы с осью симметрии второго порядка. В клетках обнаружены два изомера простагландин-Н2-синтазы, PGHS-1 и PGHS -2, которые отличаются своей активностью и тканевым распределением. В работе [261] с разрешением 3,5 А идентифицирована трехмерная структура PGHS-1 овцы - гликозилированного белка с молекулярной массой -70 кДа и 587 аминокислотными остатками. Он участвует в системе межклеточных взаимодействий, способствуя поддержанию тканевого гомеостаза. Что касается функции PGHS-2, то предполагается, что фермент ответственен за биосинтез простаглан-динов при делении клеток и воспалительных процессах.
Пространственная структура молекулы PGHS-1 состоит из трех достаточно автономных и, по-видимому, независимо свертывающихся субъединиц: малого N-концевого домена, мембраносвязанного участка цепи и ферментного домена. Первый N-концевой домен образован участком полипептидной цепи 33-72 (остатки 1-24 являются отщепляемой сигнальной последовательностью и не входят в зрелый фермент; остатки 25-32 не могли быть интерпретированы по полученным картам электронной плотности). Его конформация, стабилизированная тремя внутридоменными дисульфидными связями, близка структуре эпидермального фактора роста (EGF). Полипептидные модули, подобные EGF, найдены во многих внеклеточных белках - факторах свертывания крови, стимулирующих рост нейронов, а также в белках поверхностных клеток, необходимых для их выживания и пролиферации. Функция EGF-подобного домена молекулы PGHS-1 неизвестна. Второй домен, включающий остатки 73-116, состоит из четырех а-спиралей, ориентированных вдоль одной стороны мономера. Его конформация, высокая амфипатичность и профиль гидрофобной поверхности свидетельствуют о возможной интеграции фермента только в один липидный слой, и поэтому данный мембранный белок, согласно классификации Г. Блобеля, является монотопным [262]. Третий, самый большой каталитический домен молекулы PGHS-1 (остатки 117-587) обладает глобулярной структурой, состоящей из двух закрученных друг относительно друга и тем не менее четко различаемых лепестков. Один из них, наиболее крупный, имеет "V'-образную форму, построенную из двух а-спиралей, скрепленных, подобно лапкам пинцета, промежуточной третьей спиралью. Эта конструкция служит каркасом, вокруг которого упакованы еще четыре а-спирали и соединяющие их петли. Малый лепесток каталитического домена представляет собой пакет из шести приблизительно параллельных спиралей.
Белок PGHS-1, бифункциональный фермент, располагает двумя активными центрами: пероксидазным и циклооксидазным. Первый находится на поверхности узкой щели между большим и малым лепестками каталитического домена и содержит простетическую группу -высокоспиновый Ре(Ш)-протопорфирин IX, проксимальная поверхность которого обращена к малому лепестку. Пероксидазная активность сводится к восстановлению синтезированного в циклооксидазном центре pgg2 и активации циклооксидазной реакции. Такой механизм типичен
3. Проблема белка, т. 2
65
для гемзависимых пероксидаз, восстанавливающих гидропероксидазные субстраты путем реакции двухэлектронного переноса, приводящего к образованию оксоферрилпорфин-катионрадикала. Окисленный гем возвращается в свое первоначальное состояние при двух последовательных одноэлектронных переходах к восстанавливающимся субстратам или благодаря переходу кислорода к арилсульфидным соединениям. Молекулы PGHS-1 преимущественно восстанавливают PGG2 и другие длинноцепочечные жирные кислоты, а также алифатические гидроперо-ксидазы. Циклооксидазный активный центр представляет собой длинный узкий канал (8 х 25 А), идущий от внешней поверхности мембраносвязанного домена через его спирали к центру мономерной молекулы PGHS-1. Наблюдаемая нечеткая дифракционная картина рассеяния рентгеновских лучей кристаллами, выращенными пока что только для единственного фермент-ингибиторного комплекса, не позволила авторам предложить на основе полученных ими данных механизм каталитической реакции, протекающей в циклооксидазном центре [261].
Завершая краткое рассмотрение результатов рентгеноструктурного анализа простагландин-Н^-синтазы, следует отметить, что значение этой работы, как первого исследования трехмерной структуры мембранного фермента, заключается не только в самих экспериментальных фактах, впервые ставших известными, ценность их очевидна. Не меньшее ее значение связано с влиянием полученных данных на постановку вопросов, на качественно ином, более высоком уровне. Поиски решений таких важных вопросов как встраивание ферментов в мембраны, функции EGF-подобного модуля, конформа-ционные и химические аспекты каталитических актов, совершаемых в циклооксидазных и пероксидазных активных центрах и ряда других, представляющих общий интерес, теперь могут опираться на хотя и не в полной мере достаточные, но конкретные количественные структурные данные.
