Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
427
мРНК
* АТР
Реорганизация или диссоциация
^^hsc70t hsp70 mt hsp70
й8'"
Лизосомальная
деградация
Кроме того, в комплекс может входить различное число белков hsp70. Несмотря на то что комплекс является гетероолигомерным, до электронно-микроскопическим фотографиям он похож на гомоолигомер-ный комплекс клеток Е. coli (рис. 111.28). Внутренняя полость эт#х олигомеров, вероятно, значительно больше, чем у GroEL. В экспериментах in vitro TRiC проявляет шаперонную активность. Более подробно структура шаперонов-60 пока не изучена, однако наличие ATP-связывающего участка у каждого мономера весьма вероятно.
В экспериментах in vitro показано, что ренатурация таких ферментов как "рубиско", тиолсульфотрансферазы и а-гликозидазы происходит при образовании комплекса с шапероном-60 и шапероном-10
в присутствии АТР, ионов Mg2+ и К+ (или NH4). В отсутствие одного из этих компонентов восстановление активности фермента не происходят [242]. Стехиометрическое соотношение олигомерного шаперона в комплексе со свертывающимся белком — 1:1. Специфичность связывания в полипептидной цепи с шапероном неизвестна, однако ясно, что образуется прочный невалентный комплекс. По-видимому, прежде чем будут получены данные рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением поверхности связывания шаперона с белком, нельзя предположить достоверного механизма связывания.
Свертывание белковой цепи, вероятно, происходит на поверхности шаперона (аналогично реактивации фермента на твердой матрице). Механически "пончиковая" структура комплекса GroEL может свидетельствовать о том, что полипептидная цепь способна протягиваться сквозь пору, как при трансляции на рибосоме. Попытки оценить конформационное состояние "субстратного" белка, связанного с шапероном, предпринимались с использованием спектральных методов, метода ограниченного протеолиза и функциональных методов (по выявлению ферментативной активности, связыванию конформационных антител) [268]. Исследовали взаимодействие GroEL, как молекулярного шаперона, с белками, содержащими а-спиральные и (3-складчатые структуры, в частично свернутом и полностью денатурированном состояниях. Методом ЯМР было показано, что при взаимодействии пептида, соответствующего N-концевому а-спираль-ному участку роданазы, с шапероном исследуемый пептид принимает конформацию близкую к а-спиральной, тогда как просто в растворе его конформация случайна [294, 295]. Было предположено, что гидрофобная поверхность спирали служит "якорем" в "кармане связывания" шаперона. Но этот вывод не может быть применен к |3-складчатой структуре, например к фрагменту антитела, который взаимодействующему с GroEL.
Наиболее стройная гипотеза молекулярного механизма функционирования шаперонов при свертывании белка предложена Дж. Мартином и Ф. Хартлом [296]. Схематично механизмы представлены на рис. 111.29, где рассмотрено свертывание вновь синтезирующейся поли-
Р и с. III.29. Предполагаемый механизм свертывания синтезирующейся полипептидной цепи с участием шаперонов hsp70 (DnaK, DnaJ, GrpE) и шаперонов 60 (GroEL, GroES) [193]
429
пептидной цепи с участием шаперонов hsp70 (DnaK и вспомогательных белков DnaJ и GrpE) и шаперонинов-60 (GroEL и GroES).
При появлении N-концевого участка синтезирующейся полипептидной цепи протяженностью более 7 аминокислотных остатков из рибосомы происходит связывание шаперона DnaK. Позже при удлинении цепи до 50—60 аминокислотных остатков к цепи присоединяется вспомогательный белок DnaJ, который стабилизирует комплекс DnaK с белковой цепью и стимулирует ее АТРазную активность. По мере удлинения цепи с ней могут связываться следующие молекулы DnaK и DnaJ. При формировании такого тройного комплекса полипептидная цепь—DnaK—DnaJ происходит связывание и гидролиз АТР, причем ADP остается присоединенным к тройному комплексу и при этом сродство DnaK к полипептидной цепи увеличивается, создавая прочный комплекс. Однако для достижения белком конечной конформации необходимо ее освобождение из комплекса с шапероном. Это происходит при участии белкового регуляторного фактора GrpE, который вытесняет ADP из комплекса DnaK—DnaJ, опять происходит связывание АТР и уменьшается сродство полипептидной цепи к DnaK и ее конформационная перестройка. В том случае, когда такая перестройка приводит к формированию нативной структуры, полипептидная цепь освобождается из комплекса. Если же достижения нативной структуры не произошло, циклы повторяются.
В ряде случаев для белка недостаточно помощи hsp70 и они вынуждены прибегнуть к помощи шаперонина-60 для формирования конечной трехмерной структуры. Олигомерный белок hsp60 предотвращает неправильные взаимодействия между экспонированными участками глобул, которые могут привести к агрегации молекул белка. Шаперонины, по-видимому, взаимодействуют с уже полностью синтезированной и частично свернутой полипептидной цепью. При этом шаперонин GroEL находится в комплексе с GroES, который стабилизирует его ADP-форму, как и в случае hsp70 (DnaK—ADP стабилизируется DnaJ). Полипептидная цепь погружается в полость тороида, вероятно, формируя нековалентные связи с каждым его мономером. Сродство комплекса GroEL—GroES и связанных молекул ADP к полипептидной цепи при этом велико. Однако связывание самого белка приводит к дестабилизации комплекса, его диссоциации и освобождению ADP, который замещается на АТР. При этом сродство GroEL к белку уменьшается и белок получает свободу внутри тороида для оптимизации своей конформации. Затем происходит гидролиз АТР. ADP остается связанным с GroEL, a GroES стабилизирует эту связь, подойдя, как предполагают с другой стороны тороида. Сродство к белку внутри тороида опять возрастает и цикл повторяется вновь до тех пор пока конформация белка не станет нативной, а значит не будет взаимодействия с GroEL, дестабилизации комплекса и вытеснения ADP. В этом случае молекула белка в нативной конформации освобождается из полости тороида. Известно, что для свертывания полипептидной цепи фермента тиосульфатсульфотрансферазы необходимо 130 молекул АТР.
