Практикум по сельскохозяйственной фитопатологии - Попкова К.В.
ISBN 5-10-000407-Х
Скачать (прямая ссылка):
При анализе семян на вирусную инфекцию можно поставить 2 задачи: 1 — обнаружение зараженности партии семян без количественной оценки степени заражения; 2 — количественное определение степени заражения— процента зараженных семян или проростков, концентрации вирусов в семенах.
Различают 2 вида зараженности семян вирусами: поверхностную контаминацию и внутреннюю инфекцию. В передаче вирусов семенами участвуют оба вида зараженности, однако поверхностную контаминацию можно устранить химической обработкой семян. Внутренняя инфекция сохраняется в семенах очень долго, в большинстве случаев в течение всего срока сохранения их жизнеспособности и не устраняется полностью при химических и термических обработках семян.
Внутренняя инфекция присутствует в семенах, как правило, в очень низкой концентрации, поэтому для ее обнаружения требуется высокая чувствительность методов диагностики. Кроме того, необходимо учитывать локализацию вирусов в различных частях семени: в одних случаях основная часть внутренней инфекции находится в зародыше (ВШМЯ), в других — вирус в зародыше отсутствует (ВТМ в семенах томата).
Для определения зараженности семян используют главным образом те же методы диагностики, что и для определения вирусов в вегетирующих растениях: капельную серодиагностику, инокуляцию индикаторных растений, иммунно-ферментный анализ, электронную микроскопию.
Зараженность проростков далеко не всегда совпадает с зараженностью семян, поэтому для полной характеристики передачи вируса семенами в данном сочетании культура — вирус требуется сопоставление результатов анализа ссмян и проростков, развившихся из семян одной и той же партии.
Для анализа семян, как правило, используют гомоге-нат их пробы в воде или в буферном растворе. Его можно получить в гомогенизаторе или с помощью обычной фарфоровой ступки. Для серологической диагностики гомогенат фильтруют или центрифугируют. Для индикаторной диагностики его готовят с добавлением стабилизаторов вируса, например диэтилдитиокарбамата натрия (ДИЭКА), с целыо предотвращения инактивации вируса ингибиторами, содержащимися в семенах.
Задание 1. Определить зараженность семян ячменя вирусом штриховатоп мозаики (ВШМЯ).
Необходимое оборудование, материалы и реактивы: семена ячменя, здоровые и зараженные ВШМЯ, фарфоровая ступка, чашки Петри, фильтровальная бумага, препаровальная игла, глазная пипетка, вата, диагностическая сыворотка к ВШМЯ, контрольная сыворотка, предметные стекла, зеркальце.
Около 100 семян каждого образца раскладывают в чашки Петри па влажной фильтровальной бумаге и оставляют при комнатной температуре до наклевывания. Проросшие зародыши выделяют препаровальной иглой и растирают в ступке с 5 мл дистиллированной воды. Полученный гомогенат фильтруют глазной пипеткой через комочек ваты. Две капли полуосветлепного экстракта наносят на предметное стекло. К одной из капель добавляют диагностическую сыворотку к ВШМЯ, к другой— контрольную сыворотку. Стекло со смешанными каплями оставляют па 15 мин для инкубации реакций, затем определяют результат, освещая капли снизу с помощью зеркальца.
При положительной реакции в смеси экстракта с диагностической сывороткой тонкая взвесь собирается в хлопья. Ход работы и результаты анализа записывают в тетрадь.
Некоторые фитопатогепные вирусы, переносимые семенами, и методы их диагностики указаны в таблице 10.
3 а д а и п с 2. Определить зараженность семян томата вирусом табачной мозаики (ВТМ).
Необходимое оборудование, материалы и реактивы: семена томата, здоровые и зараженные ВТМ, ступка, пипетка, вата, диагностическая сыворотка к ВТМ, контрольная сыворотка, живые листья дикого клейкого табака (Nicotiana glutinosa L.) или гибридного табака (Л/, iabacum L.) сорта Xanthi, чашки Петри с влажной фильтровальной бумагой.
Около 50 семян каждого образца растирают в ступке с 2 мл 0,1%-ного раствора ДИЭКА. Гомогенат фильтруют пипеткой через вату. Две капли фильтрата наносят на предметное стекло. Далее поступают, как указано в задании 1. При отрицательном результате серологической диагностики оставшимся в ступке гомогеиатом ннокулируют путем натирания (не нанося видимых по-
10. Некоторые фитопатогенные вирусы, переносимые семенами, и методы их диагностики
Культура Анализиру Методы
Вирус емый диагностики Растения-индикаторы
материал
Ячмень ВШМЯ Зародыши, кем, им, Chenopodium Qui
проростки ЭММ noa Willd.
Томат ВТМ Семена * КСМ, ИМ, Nicoticina glutinosa
ИФА L., N. tabacum L.,
сорт Xanthi
» » Проростки ИМ, ИФА Cucumis sativus L.
Тлбак » Семена ИМД, ИФА C. sativus L., N. ta
bacum L., N. gluti
nosa L.
Соя ВМС ИМ Phaseolus vulga
