Практикум по цитологии растений - Паушева З.П.
ISBN 5-10-000614-5
Скачать (прямая ссылка):
При изучении картин двойного оплодотворения нередко испытывают затруднения в выборе фиксатора и способов окрашивания препаратов. Наиболее распространены фиксации по На-вашину или Карнуа или предварительная фиксация — несколько минут по Карнуа, а затем по Навашину.
Спермии хорошо выявлять путем окрашивания препаратов по методу Фёльгена. Однако при этом ядра яйцеклетки часто не обнаруживают положительной реакции на ДНК до оплодотворения или эта реакция недостаточно четкая. Некоторым исследователям удавалось добиться положительной реакции на ДНК в ядре яйцеклетки, используя в качестве фиксатора 10%-й раствор формалина. Из других методов можно использовать окрашивание по Делафильду, Гейденгайну и Я. С. Модилев-скому.
Методы приготовления препаратов и наблюдения пыльцевых трубок
Методика приготовления препаратов прорастающих пыльцевых трубок. Для изучения пыльцевых трубок у растений различных родов и семейств (.Antirrhinum, Brassica, Raphanus, Sobanum и др.) Герр со ссылкой на Dionne описал следующий метод фиксации, мацерации и окрашивания.
Опыленное рыльце фиксируют в уксусном алкоголе (3:1) в
течение 1 ч. Для мацерации его помещают в горячий 45%-й раствор уксусной кислоты при температуре 60°С на 10—60 мин, в зависимости от объекта. Для окрашивания готовят раствор, состоящий из 7,5 мл 2%-то раствора сафранина, 1 мл 2%-го анилинового. голубого (растворы красителей водные, с добавлением 1—2 капли хлороформа в качестве антисептика) и 25 мл 45%-го раствора уксусной кислоты. Раствор подогревают до 75°С и перед употреблением фильтруют. Рыльце перед окрашиванием осторожно расчленяют иглой. Окрашивание длится 5—15 мин. После этого препарат мягко раздавливают и изучают под микроскопом.
Для фиксации и окрашивания пыльцевых трубок гречихи и злаков, по методикам Моррисона и Уоткинса, используют лактофенол с растворенным в нем 1%-м раствором красителя (кислый фуксин или коттон-блау). Для дифференцировки в ходе окрашивания применяют чистый лактофеиол (см. с. 96).
Прорастающие ныльцевые зерна на рыльце и в столбике хорошо наблюдать после окраски ацетокармином. Для этого готовят 45 % -й раствор ацетокармина с глицерином или молочной кислотой в соотношении 1:1. В эту смесь помещают опыленный столбик, затем препарат подогревают и изучают под микроскопом.
У плодовых и ягодных растений пыльцевые трубки хорошо окрашиваются, метиленовым синим (0,1—0,01%) после фиксации 3%-м раствором формалина и легкого раздавливания на стекле.
Пыльцевые трубки в столбике хорошо выявляются раствором йода в йодиде калия (см. с. 210). Этот метод можно применять для изучения пыльцевых трубок у ржи,-гречихи, пшеницы. В ряде случаев при использовании этого метода необходима обработка 60%-м раствором молочной кислоты при 60°С или 10%-м раствором КОН в 70%-м — этилового спирта. Четко окрашиваются пыльцевые трубки и по Фёльгену (см. с. 100).
Методика выявления пыльцевых трубок
флуоресцентным методом
Можно взять опыленные свежие, а также фиксированные пестики в фиксаторе Чемберлена или уксусном алкоголе. Для мацерации тканей используют 1 н. растворы NaOH или КОН. Чтобы вызвать размягчение тканей томата, достаточно 1 ч при комнатной температуре, косточковым нужно двое-трое суток. Время обработки можно сократить, если кипятить объекты в щелочи в течение 10 мин. Затем их промывают в воде и помещают в раствор 0,1%-го анилинового синего, разбавленного 0,1 н. К3РО4. Утром пестик переносят в каплю глицерина на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и осторожно расплющивают или разрезают вдоль лезвием бритвы, пользуясь стереоскопическим микроскопом. Просмотр ведут под микроскопом с освети-
телем ОИ-18 и светофильтрами УСФ-6'толщиной 3 и 5 мм или-под люминесцентным микроскопом, наблюдая свечение пыльцевых. трубок.. Описанную методику удобно использовать, для определения совместимости растений, при скрещивании., .
СЕЛЕКТИВНОЕ ОПЛОДОТВОРЕНИЕ
Не все пыльцевые трубки обладают равной оплодотворяющей способностью, и если в столбике их прорастает несколько, то. совершает оплодотворение обычно одна.
Гетерозиготные особи образуют гаметы нескольких типов. Так, генотип Аа дает гаметы А и а в соотношении 1:1. При этом можно ожидать, что поскольку гаметы гетерозиготной особи неодинаковы по составу наследственных факторов, то они по-разному будут участвовать в оплодотворении. Тогда при, скрещивании гетерозигот АахАа вместо ожидаемого расщепления по фенотипу 3: 1 будет несколько иное расщепление, так как нарушается равная вероятность образования различных, типов зигот. Данное явление называется селективным оплодотворением. Этот термин предложил Джонс. Установлено, что селективность оплодотворения зависит от скорости роста пыльцевых трубок, а последняя определяется действием гаметических факторов. Например, у кукурузы мелкие пыльцевые зерна не могут конкурировать с нормальными.
В 1902 г. Коррейе впервые обнаружил отклонение от соотношения 3: 1 в потомстве гибрида между рисовой и сахарной кукурузой. В одном случае наблюдалось 16% особей с рецессивными признаками вместо 25%. В 1922 г. он же наблюдал отклонение от ожидаемого расщепления в результате скрещивания-женских гомозиготных особей дремы белой (Melandrium album) с гетерозиготными"мужскими особями того же вида, В потомстве был избыток женских особей вместо ожидаемых 50%, что объясняли различной скоростью роста пыльцевых трубок, несущих определитель пола.
