Практикум по цитологии растений - Паушева З.П.
ISBN 5-10-000614-5
Скачать (прямая ссылка):
Приготовление 2SSC. 17,55 г NaCl и 10,7 цитрата натрия (СбНзОгЫаз-
• 5,5И20) довести водой до 1 л (pH 7).
16. Промывание препаратов в дистиллированной воде и сушка в течение 15 мин при 60 °С в термостате. '
17. Выдерживание сухих препаратов в растворе красителя в концентрации 1 : 15 азур-эозина по Романовскому на фосфатном буфере при pH 6,8 в течение 20 мин (время устанавливают в зависимости от объекта путем контроля под микроскопом).
Приготовление фосфатного буфера. l/is М Ма2НРО-12НгО (9,46 г доводят водой до 1 л) и '/is М КН2РО4 (9,1 г доводят водой до 1 л). Затем смешивают по 50 мл каждого раствора для получения буфера pH 6,8.
18. Промывание препаратов в дистиллированной воде несколько раз и высушивание их.
.19. Помещение препаратов в ксилол и заключение в канадский бальзам.
В приведенной методике мацерация корней осуществляется с использованием ферментов и ацетатного буфера. Препарат готовят из суспензии клеток после центрифугирования. При одной из модификаций этого метода в качестве фиксатора используют уксусный алкоголь (3:1). Для мацерации тканей берут 45%-й раствор уксусной кислоты при слабом нагревании с последующим окрашиванием корней ацетокармином или азур-эозином. После приготовления давленого препарата его помещают на сухой лед, удаляют покровное стекло, обезвоживают в серии растворов спирта или в 96%-м его растворе. Сушат на воздухе не менее суток или 1 ч в термостате при 60 °С и обрабатывают 3,5%-м раствором гидроксида бария 12 мин.
Методика исследования полового хроматина
Половой хроматин (тельце Барра) легко обнаруживается в ядрах клеток слизистой полости рта у женщин. По современным представлениям, из двух J-хромосом половой хроматин обра-
зует только одна, находящаяся в неактивном состоянии. Число ядер, содержащих половой хроматин, составляет у женщин 40% (с колебанием от 20 до 71%), у мужчин — 0—0,3%. Таким образом, половой хроматин выявляется у женщин и редко у мужчин. При отклонении от нормы по числу Х-хромосом половой хроматин можно обнаружить у мужчин при синдроме Клайнфельтера (соматическое число хромосом 47, из них половых хромосом три: JXK).
' У женщин с синдромом Шерешевско-го—Тернера (соматическое число хромосом 45, из них одна половина Х-хромосо-ма) половой хроматин не выявляется.
Для приготовления давленых препаратов необходимо взять шпателем соскоб из полости рта и сделать мазок на предметном стекле. Мазок окрашивают в ащетоорсеине и через пять минут препарат просматривают под микроскопом. Отыскивают интерфазные ядра. Тельца полового хроматина имеют неодинаковую форму и обычно хорошо видны на фоне мелкозернистой нуклео,плазмы (рис. 63).
Методы приготовления давленых препаратов для изучения хромосом с учетом особенностей сельскохозяйственных культур
Пшеница. В работе с .пшеницей-(особенно мягкой) наиболее интересны исследования по использованию анеуплоидин для генетического анализа, получению межсортовых замещенных линий (например, линий, у которых одна пара хромосом замещена парой хромосом другого сорта), созданию линий путем добавления хромосом одного вида или рода к хромосомному набору пшеницы. Для решения подобных задач и выявления анеуплоидов необходим точный цитологический анализ.
Ниже приведена методика приготовления препаратов для изучения соматических хромосом пшеницы, .предложенная в 1958 г. Райли и другими исследователями. С учетом некоторых дополнений она выглядит так.
Семена замачивают в дистиллированной воде и ставят в чашках Петри на сутки в термостат при температуре 25—26°С, затем сливают воду и на день семена помещают в холодильник при 3—4°С, а на ночь снова в термостат при 25—26 °С. Переменный режим обеспечивает быстрое отрастание корней длиной
1—1,5 см с максимальным числом клеток, находящихся в метафазе.
Рис. 63. Интерфазное ядро, содержащее половой хроматин (а).
Отрезанные корни (до 10 мм) помещают в насыщенный раствор а-бромнафталина на 5 ч при комнатной температуре (или на сутки в холодильник). Фиксацию осуществляют в ледяной уксусной кислоте не менее 30 мин. За фиксацией следует гидролиз в нормальной соляной кислоте при 60 °С в течение 12 мин и окрашивание реактивом Шиффа 1—2 ч. После этого корни помещают на предметное стекло, отрезают кончики, добавляют каплю 45%-го раствора уксусной кислоты, накрывают покровным стеклом и раздавливают объект так, чтобы клетки корня распределились в один слой (см. рис. 59).
Рожь. Семена проращивают в чашках Петри на влажной фильтровальной бумаге при температуре 23—25°С в течение 35—40 ч в темноте. Для активации деления и получения максимума метафазных пластинок наклюнувшиеся >семена сначала переносят в холодильник или в снег на 3—4 дня при температуре от нуля до —4°С, а затем ставят в термостат на ночь при 24—26 °С. Проросшие зерновки с корнями помещают до фиксации в смесь, состоящую из 0,2%-го раствора колхицина и насыщенного раствора а-бромнафталина (его добавляют по одной капле на 10 мл раствора колхицина) на 2 ч.
После предобработки кончики корней величиной 1—1,5 см обрезают и фиксируют в уксусном алкоголе (3:1) до суток. После фиксации материал промывают в 70%-м растворе спирта, мацерируют в 10%-м растворе соляной кислоты 8 мин и помещают в 2%-й раствор ацетокармина для окрашивания при слабом нагревании красителя. Хорошие результаты также дает окрашивание в реактиве Шиффа в течение 2 ч с предварительным гидролизом в 1 н. НС1 при 60 °С 5—8 мин. Кончик корня с зоной деления раздавливают на предметном стекле в капле 45%-го раствора уксусной кислоты.
