Практикум по цитологии растений - Паушева З.П.
ISBN 5-10-000614-5
Скачать (прямая ссылка):
Для идентификации хромосом лука (Allium сера) проводят следующую работу. Проростки семян с корнями длиной 10—
15 мм помещают на 2 ч в 0,025%-й раствор колхицина при 22°С, а затем на 2 ч в насыщенный раствор 8-оксихинолина при 10 °С, фиксируют в уксусном алкоголе и окрашивают по Фёльгену. При отборе пластинок с хромосомами необходимо следить, чтобы степень конденсации хромосом варьировала в узком интервале, хромосомы не налегали друг на друга, разделение на хроматиды было четким.
Морфометрический метод нередко сочетают с составлением поликариограмм. Для этого строят график. На оси абсцисс откладывают центромерный индекс, на оси ординат— относительную длину хромосомы. На графике выявляется положение хромосом относительно друг друга в общем наборе.
Следует отметить, что при описании кариотипов и характеристике отдельных хромосом не всегда используют одинаковую терминологию и обозначения. Приведем обозначения, которые применяют во Всесоюзном научно-исследовательском институте растениеводства (Л. И. Абрамова; 1965, 1971).
Длинные хромосомы (см. рис. 57) обозначаются буквой L (англ. long — длинный), средние — М, короткие — S. Характеристика хромосом по морфологии основана на положении центромеры. При среднем положении центромеры у .метацентриче-ских хромосом говорят о медианной центромере (т); у субме-тацентрических хромосом центромера субмедианная (s); положение центромеры у акроцентрических хромосом сдвинуто к одному из коротких плеч и обозначается буквой а.
Характеристику хромосом записывают в виде заглавной буквы, обозначающей ее размер, и малой буквы, расположенной ниже строки, отмечающей положение центромеры. Наличие вторичной перетяжки (с) и спутника (t) указывают в виде индекса заглавной буквы выше строки. Цифры перед заглавной буквой указывают на число пар сходных хромосом в гаплоидном наборе хромосом. Прежде чем составить запись (см. рис. 57), надо изучить формулу кариотипа на примере купены Poligonatum humile (2п = 20):
l^m4“l/^Cm + 3Ms--|-lMCa-f-15,m-f-25,s--j- lSg.
Методика дифференциально го окрашивания хромосом. Различные участки хромосом, имея неодинаковую степень конденсации, приобретают способность связываться с основными красителями так, что появляется .поперечная ис-
Рис. 62. Идиограмма дифференциально окрашенных хромосом пырея сизого (Agropyron glaucum): I—XXI —
номера хромосом. По Т. А. Потаповой, А. И. Щаповой.
Ш.
Ж
ш
ж
черчеиность хромосом. Это используют для идентификации хромосом. Различают шесть типов полос в зависимости от техники окрашивания: Q, С, R,
G, Т, N. Наиболее эффективен для растений С-метод, позволяющий выявить гетерохроматиновые участки по длине хромосомы (рис. 62).
Ниже приведено приготовление препаратов по С-методу, начиная с предобработки и фиксации материала, его осуществляют по методике, применяемой во ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии ВАСХНИЛ. Порядок работы следующий.
1. Проращивание семян ржи, пшеницы, тритикале в чашках Петри при 24°С до образования корней длиной 1—2,5 см.
2. Предобработка корней (вместе с семенами) в 0,2%-м растворе колхицина (можно добавить а-монобромнафталин) в течение 2 ч.
3. Промывание корней в ледяной воде 1—2 ч.
4. Подсушивание корней фильтровальной бумагой и фиксация их в 45%-м растворе уксусной кислоты. Корни оставляют на ночь в холодильнике.
5. Промывание корней в воде и гидролиз в 0,2 н. НС1 5 мин при 60 °С на водяной бане.
6. Промывание корней в воде.
7. Мацерация отрезанных кончиков корней в 1—2%-м растворе ферментов (пектиназа, цитаза или целлюлаза) с участием ацетатного буфера при pH 4,8 в течение ночи. В зависимости от объекта смешивают несколько кашель буфера и фермента (одно из возможных соотношений 12:2).
Приготовление ацетатного буфера. 27,2 г ацетата натрия растворить в 1 л воды (1) и отдельно 11,2 мл ледяной уксусной кислоты растворить в 1 л воды (2). Взять 60 мл раствора 1 и 40 мл раствора 2 для получения буфера с pH 4,8.
8. Приготовление из мацерированных кончиков корней суспензии клеток путем тщательного перемешивания их в пробирке и центрифугирование ее-.
9. Промывание осадка водой и повторное центрифугирование.
10. Добавление к осадку 45%-го раствора уксусной кислоты .и приготовление давленого препарата из суспензии клеток.
11. Просмотр препарата под микроскопом с фазово-контрастным устройством.
12. Перенос препарата на сухой лед, отделение покровного стекла, обезвоживание в спиртах от 60 до 100%-й концентрации и подсушивание теплым воздухом.
13. Обработка сухих препаратов перед окрашиванием насыщенным раствором гидроксида бария Ва(ОН)2 6—8 мин.
14. Промывание препаратов в 1 н. НС1, затем дистиллированной водой.
15. Выдерживание подсушенных препаратов в растворе, условно обозначенном 2SSC, при 60 °С в течение часа.
