Практикум по цитологии растений - Паушева З.П.
ISBN 5-10-000614-5
Скачать (прямая ссылка):
Особое значение в цитофотометрии имеют фиксаторы. Так,
ф = ф0е' %%Ch
или
Величину In -—-называют экстинцией.
фиксатор ФСУ, состоящий из формалина, этилового спирта, уксусной кислоты, смешанных в соотношении 3: 1 :0,3 (при фиксации не более 6 ч), сохраняет ДНК, РНК, белки, а нейтральный формалин при обработке в течение 10—15 ч сохраняет ДНК, РНК, белки и липиды. Однако формалин может изменить массу клетки.
В тех случаях, когда можно сделать выбор в пользу количественного изучения состава объектов на срезах или мазках, предпочтение отдают мазкам. Возможно применение и давленых препаратов.
Цитофотометрия осуществляется следующими методами: фо-тометрирования большого поля; двухволновым; одноволновым двух площадей; точечным; сканирования; логарифмического экрана.
Наиболее распространен из них точечный, а самый простой — метод фотометрирования большого поля. При точечном методе измеряют поглощение фиксированным зондом, размер которого меньше размера объекта. Затем определяют площадь клетки, чтобы вычислить общее количество вещеЬтва в ней. Более точные результаты получают, когда фотометрируют не один, а множество участков в клетке. В развитие этого метода создан метод сканирования, когда последовательно фотометрируют всю площадь клетки. В отличие от перечисленных при работе методом логарифмического экрана изображение клетки и окружающего ее фона проектируется на логарифмический преобразователь светового потока.
Особо следует остановиться на фотографической цитофотометрии. В этом случае объекты фотографируют в монохроматическом свете и изучают негативы одним из указанных выше методов.
Фотографирование ведут на обычном микроскопе с осветителем, используя монохроматор. Микрофотосъемку в желто-зеленых, зеленых и синих лучах осуществляют на пленке Микрат-200, которую проявляют при 18°С, используя проявитель № 2:
Время проявления 5—6 мин. Закрепитель используют обычный. К фотографированию приступают только тогда, когда подобраны выдержки для фотографирования ступенчатого ослабителя и объекта, режим проявления фотопленки. Сначала на рабочую пленку снимают ступенчатый ослабитель, а затем объект.
Ступенчатый ослабитель представляет собой кварцевое стекло' с напыленными на него полосками платины различной тол-
метол .... сульфат натрия . . сода безводная бромат калия вода . . I .
8 г
125 г 5,75 г 2,5 г
до 1 л
щины. Его применяют в качестве эталона для характеристики контрастности эмульсии при определенной длине светового потока.
Определение концентрации вещества возможно тогда, когда коэффициент контрастности негатива не менее 0,8 и не более 1Д
Количество поглощающего вещества (G) определяют по формуле
с- (U»-UJS
Т
где С/0 — усредненное значение плотности почернения негатива для различных точек фона, U\ — то же, но для объекта (получают эти значения, пользуясь логарифмической шкалой микрофотометра); у — контрастность негатива; S — площадь объекта.
Для определения площади объекта проектируют его изображение на лист бумаги с помощью фотоувеличителя и контуры обводят планиметром.
Для фотометрирования негативов используют микрофотометр МФ-4, дающий возможность осуществить точечный метод, или метод сканирования.
При работе на микрофотометре МФ-4 негатив помещают на столик между лампой и фотоэлементом. Свет от лампы проходит через объект и попадает на фотоэлемент, возбуждая в нем фототок, который поступает в гальванометр. В зависимости от изменения плотности объекта изменяется отсчет на шкале.
Порядок работы на микрофотометре МФ-4 (контролируют по описанию прибора) следующий.
1. Включение прибора в сеть.
2. На столик между стеклянными пластинками кладут негатив; при появлении на зеленом экране изображения негатива его фиксируют специальными винтами.
3. Передвигают столик на незасвеченный участок негатива.
4. Добиваются появления на логарифмической шкале цифры 0, для чего специальным винтом уменьшают цель экрана.
5. Добиваются, чтобы стрелка на логарифмической шкале совпала со знаком оо, для чего тумблером прекращают доступ света к фотоэлементу.
6. Приступают к измерению плотности негатива. Сначала проводят измерения плотностей почернения ступенчатого ослабителя для определения контрастности пленки, а потом определяют почернение фона (Uo) и объекта (Ui).
Для фотометрии и измерения ряда оптических констант можно использовать фотометрическую насадку ФМЭ-1, которая легко комплектуется с микроскопом. В комплект ФМЭ-1 входят пульт управления и блок питания..
Фотометрическую насадку устанавливают в гнездо головки тубусодержателя микроскопа вместо бинокулярной насадки. Окуляр вставляют в специальный патрубок. После настройки в поле зрения окуляра видны одновременно изображение объекта и изображение светового зонда (в виде пятна). В верхней части насадки устанавливают фотоумножитель для преобразования светового потока в электрические сигналы. Работает насадка с монохроматическим светофильтром. Регистрирующим устройством является балансная схема усилителя постоянного тока с измерительным прибором.
