Практикум по цитологии растений - Паушева З.П.
ISBN 5-10-000614-5
Скачать (прямая ссылка):
КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ЦИТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Выявляя те или иные вещества в клетке, нередко приходится давать им количественную характеристику. Особенно часто встает вопрос о содержании в клетках ДНК, РНК, белка и некоторых других соединений. Современные методы количественного анализа включают: цитофотометрию, цитофлуориметрию, цитоинтерферометрию, авторадиографию, электронно-микроскопическую цитохимию (табл. 2).
Цитофотометрия, или абсорбционный метод, основана на определении веществ по избирательному поглощению ими света определенной части спектра.
Цитофлуориметрия позволяет определить количество вещества в клетке по интенсивности и спектру его флуоресценции или самого флуорохрома.
Цитоинтерферометрия дает возможность определить сухую массу клетки на основе величины сдвига по фазе проходящего через нее света.
Авторадиография основана на введении меченых предшественников в среду, из которой клетка поглощает их и использует для
Метод Определяемое Краситель, изотоп Спектраль Максимум
вещество ный диа поглощения
пазон (излучения)
Цитофотомет днк, рнк УФ 260 нм
рия Белки УФ 280 нм
днк Фуксин по Фёльге- Видимая 560 нм
ну часть
ДНК, РНК Галлодианин бром- То же 570 нм
Белки феноловый синий
Гистоны и прота- Прочный зеленый » » 635 нм
мииы
Цитоинтерфе Белки (сухая мас Видимая
рометрия са клетки) ' часть
Цнтофлуори- днк Акридин оранже То же 530 нм
мстрня вый
РНК То же » » 650 нм
Белки Проционовый 4 RS » »
Липиды Проционовый жел » »
тый 1
Авторадиогра днк И3-тимидин
фия Сн-тнмидии
РНК Hs-y ридин --- ---
Н3-цитидин
Белки S;'5-меченые ,
аминокислоты
синтеза нуклеиновых кислот, белков и других веществ. Препарат
покрывают специальной фотоэмульсией, с помощью которой можно обнаружить радиоактивность клетки. По числу зерен восстановленного серебра определяют количественные характеристики радиоактивности.
Электронно-микроскопическая цитохимия позволяет определить сухую массу отдельныхоргаиелл клетки по уменьшению интенсивности пучка электронов вследствие рассеяния их атомами органелл.
Цитофотометрия
В основе метода лежит закон Бугера-Бера. Согласно Бугеру вероятность поглощения фотонов света определяется свойствами поглощающего вещества и длиной фотонов, что выражается формулой
ф -
где Ф и Фо — прошедший и падающий световые потоки; е — основание натуральных логарифмов; К*. — показатель поглощения вещества при прохождении монохроматического света с длиной волны Аh — длина пути светового пучка через поглощающую среду (по Ю, Р. Хрусту с соавт., 1978).
По Беру, Кк определяется концентрацией поглощающего вещества С и удельным показателем поглощения %*,:
К^ - ХхС.
Закон Бугера-Бера может быть выражен в виде следующих уравнений:
Итак, концентрация поглощающего вещества связана логарифмической зависимостью с ослаблением монохроматического светового потока, проходящего через среду.
Общее количество поглощающего вещества (G) определяют по формуле
где V — объем объекта.
Учитывая, что V~hS, где S — площадь.сечения объекта, формула принимает вид
Наличие монохроматического светового потока является необходимым условием в работе. Фотометрируемый участок принято называть зондом. В итоге необходимо определить логарифм ослабления монохроматического потока света и площадь сечения объекта. Если значение неизвестно, количество вещества G выражают в относительных единицах.
В работе необходимо обратить внимание на коэффициент преломления среды, в которую заключен объект, чтобы свести до минимума неспецифические потери света (для фиксированных объектов лучше брать канадский бальзам), постоянство толщины поглощающего слоя и гетерогенность структуры объектов.
Поскольку спектры поглощения света в ультрафиолетовой части у белков, ДНК, РНК близки между собой, для выявления этих веществ используют специальные красители. Последнее влечет за собой определение не самих веществ, а спектров поглощения красителей, которые расположены в видимой части света.
