Практикум по цитологии растений - Паушева З.П.
ISBN 5-10-000614-5
Скачать (прямая ссылка):
Ферменты
Определение фосфатазы. Одни из наиболее распространенных ферментов, участвующих в расщеплении сложных органических соединений, — гидролазы. К ним относятся фосфатазы, гидролизующие эфиры фосфорной кислоты. В процессе дыхания фосфатазы расщепляют фосфорные эфиры сахаров. Наиболее известные фосфатазы — это рибонуклеаза и дезоксирибонуклеаза. Выявляют фосфатазы на свежем материале. В качестве фиксаторов берут 10%-й раствор формалина или 90%-й — спирта.
Реакция на кислую фосфатазу. Необходимые реактивы: 2%-й раствор ^-глицерофосфата натрия — 2 мл (1); 0,1 М ацетатный буфер (смесь растворов уксусной кислоты и ацетата натрия в соотношении 4: 1), pH 5—1 мл (2); 2%-й раствор ацетата свинца— 1 мл (<?); 0,5%-й раствор хлорида магния—1 мл (4); раствор желтого сульфида аммония (5); глицериножелатин (6).
Реакция основана на высвобождении ионов фосфорной кислоты и образовании фосфата свинца, который после обработки сульфидом аммония превращается в коричневый сульфид свинца.
Первые четыре реактива сливают вместе. В смесь помещают объект при 37 °С на несколько часов. Затем его следует ополоснуть дистиллированной водой и обработать сульфидом аммония в течение 1—2 мин. Еще раз промыв объект водой, можно заключить его в глицериножелатин.
Определение окислительн о-в о сстановитель-ных (дыхательных) ферментов. Реакцию на перокси-
дазу проводят с участием двух реактивов: бензидина или гваякола. Определение жизнеспособности пыльцы по В. С. Шардако-ву основано на бензидиновой реакции (см. с. 214).
Гваякол представляет собой метилированный фенол, дающий с пероксидазой яркую коричневую окраску. Необходимые реактивы: 0,03%-й раствор перекиси водорода; 0,7%-й раствор
гваякола; 25%-и раствор уксусной кислоты. Вначале объект обрабатывают уксусной кислотой, чтобы устранить диффузию продуктов реакции, затем добавляют одну каплю перекиси водорода, гваякол и накрывают покровным стеклом.
Наиболее просто определить аэробные неспецифические дегидрогеназы с использованием 0,05%-го раствора метиленовой синей в воде или фосфатного буфера с pH 7,6—8. Свежий материал помещают на 15 мин в раствор красителя. В присутствии ферментов идет обесцвечивание клеток.
Реакция на цитохромоксидазу. Растворить 11,876 г Na2HP04-2H20 в 1 л дистиллированной воды; отдельно растворить 9,078 г КН2Р04 также в 1 л воды. Слить растворы в соотношении 1 : 9. Получается фосфатный буфер с pH 5,8, являющийся оптимальной средой для данного фермента. Затем растворяют
0,136 г диметилпарафенилендиамина в 100 мл буфера — получится раствор 1. Отдельно растворяют 0,144 г а-нафтола в 100 мл буферного раствора (2). Растворы 1 я 2 сливают в соотношении
1 : 1 (нади-реактив). Объект помещают в каплю этого реактива. Через некоторое время цитохромоксидаза в присутствии цитохрома с окисляет нади-реактив с образованием индофенолового синего.
Удобны для наблюдений зародыши семян, пестики и другие объекты.
Физиологически активные вещества
К физиологически активным веществам относятся аскорбиновая кислота, гетероауксин, сульфгидрильные соединения, содержащие SH-группы, и др.
Определение гетероауксина. Используют реактив Сальковского, дающий фиолетово-красное окрашивание. Для приготовления его растворяют 0,1 г железоаммонийных квасцов в 100 мл 50%-ного раствора серной кислоты (для нежных объектов этот реактив разбавляют). Объект помещают в реактив Сальковского, осторожно подогревают и следят за появлением окрашивания. Реакция неспецифична.
Определение аскорбиновой кислоты (витамин С). Используют способность кислоты восстанавливать нитрат серебра в темноте. Готовят 5%-й раствор нитрата серебра в 5%-м растворе уксусной кислоты. В него помещают объект на 15—20 мин в темноте. Продукт реакции — черные кристаллы восстановленного серебра.
Определение дубильных веществ. Эта группа веществ образуется в клеточном соке, неоднородна в химическом отношении и способна давать с растворами солей железа голубовато-черное окрашивание. Используют свежий или фиксированный в формалине материал. Для определения готовят на холоде концентрированный раствор сульфата железа. Препарат с каплей раствора подогревают до 60 °С.
Определение эфирных масел. К эфирным маслам относят различные по химическому составу соединения, но наибольшее значение имеют терпены. Эфирные масла легко растворимы в спирте, уксусной кислоте. Для их выявления используют те же красители, что и для жиров.
Определение алкалоидов. Растения могут содержать различные алкалоиды: никотин, кофеин, соланин, атропин, колхицин, хинин и другие, обладающие ядовитыми свойствами соединения. Чаще всего алкалоиды встречаются у двудольных растений. Эти вещества нерастворимы в воде, но растворимы в спирте.
Для их выявления используют чистую серную или соляную кислоту. Можно брать смесь из 10 капель сильно разведенной соляной кислоты и 20 мл концентрированной серной. Цвет продуктов реакции зависит от природы алкалоидов. В качестве реактивов можно использовать смесь пергидроля и серной кислоты (1 : 10), приготовленную на холоде.
