Практикум по цитологии растений - Паушева З.П.
ISBN 5-10-000614-5
Скачать (прямая ссылка):
Давленые препараты необходимы при изучении митоза, ка-риотипов, хромосомных нарушений в корешках и конусах нарастания стеблей, мейоза в молодых пальниках.
Наиболее часто для изготовления давленых препаратов используют фиксаторы Кариуа (6:3: 1), Ныокомера (6 : 3 : 1 : 1 : 1), Баталья (5:5:1 : 1), уксусный алкоголь (3: 1), ледяную уксусную кислоту и др. Когда трудно считать хромосомы или они длинные, применяют специальные методы предобработки, о которых было сказано выше (см. с. 60). Так, для кариологического анализа корни скерды зеленой перед фиксацией обрабатывают
0,05%-м раствором колхицина обычно в течение 2 ч. Кроме кол-
хицина, можно брать насыщенные растворы парадихлорбензола или 0,002 М 8-оксихинолина. Эти два раствора готовят в термостате при 60°С. Для предобработки корней перед фиксацией хорошие результаты дает насыщенный в воде раствор монобром-нафталина. Для подсчета числа хромосом возможна фиксация корней при пониженной температуре (2—3°С).
Фиксированный материал хранят в холодильнике в фиксаторе или промывают в 96%-м растворе этилового спирта и хранят в 70%-м его растворе до окрашивания.
При изготовлении давленых препаратов исключительное значение имеют способы мацерации тканей до окрашивания (лат. maceratio — размягчение; в данном случае обработка объекта, чтобы вызвать распад ткани иа отдельные клетки). Обычно для этого используют 45%-ный раствор уксусной кислоты (для твердых объектов ее подогревают), 40—45.%-й — пропионовой кислоты, 1 н. раствор соляной кислоты, различные энзимы (пектиназа, цитаза) и др. Окрашивают препараты ацетокармином, ацетоор-сеином, пропионовым гематоксилином и др.
Ниже приведены наиболее распространенные методы приготовления красителей и окрашивания давленых препаратов.
Окрашивание препаратов
Окрашивание а ц е т о к а р м и н о м, ац е т о о р с е и н о м, ацетолакмоидом и метиленовой синей.
Приготовление красителей. Ацетокармин. Наиболее распространен следующий метод. Растворяют 1 г (лучше 2—4 г) кармина — красящего вещества, состоящего из карминовой кислоты, — в 45 мл ледяной уксусной кислоты и 55 мл дистиллированной воды. Растворение ведут в колбе с обратным холодильником на водяной бане с подогревом около 3 ч. При отсутствии обратного холодильника в колбу вставляют воронку. После остывания темно-красный раствор кармина фильтруют и помещают в посуду с притертой крышкой. Для работы его наливают в капельницы. Остатки кармииа на фильтре можно использовать повторно.
Можно готовить кармин по методу Сноу на этиловом спирте с добавлением НС1. Для этого 4 г кармина сначала растворяют в 15 мг горячей воды и добавляют 1 мл HG1. Остывшую смесь разбавляют 95 мл 85%-го раствора спирта и фильтруют.
Ацетоорсеин. Готовят орсеин из орсина — красящего начала природной краски, получаемой из лишайника. Растворяют 1 г орсеина в 45 мл горячей уксусной кислоты и добавляют 55 мл дистиллированной воды, кипятят на водяной бане 3 ч, остужают и после фильтрации раствор готов к употреблению.
Ацетолакмоид. Растворяют 2 г лакмоида в 100 мл 45%-го раствора уксусной кислоты и кипятят 2 ч в колбе с обратным холодильником. После испарения добавляют уксусную кислоту до первоначального объема. Раствор используют после фильтрации.
Метиленовая синяя. 100—500 мг краски растворяют в 100 мл дистиллированной воды.
При использовании всех этих красителей в качестве фиксатора для корней чаще всего применяют уксусный алкоголь
(3: 1). Если для окрашивания берут ацетоорсеин, ацетокармин или ацетолакмоид, объекты помещают в раствор одного из них, подогревают на спиртовке, доводят до легкого кипения несколько раз, особенно если не была проведена мацерация в НС1.
Корни злаков труднее окрашиваются и мацерируются, поэтому приходится увеличивать время их окрашивания. Так, корни ячменя, пшеницы иногда выдерживают в ацетоорсеиие от одних до полутора суток при комнатной температуре.
После этого объект кладут на предметное стекло в каплю 45%-го раствора уксусной кислоты или хлоралгидрата (5 г хлоралгидрата растворяют в 2 мл дистиллированной воды), отделяют конус нарастания, удаляют лишние ткани, накрывают покровным стеклом и фильтровальной бумагой и постукивают сверху спичкой, чтобы уложить клетки конуса нарастания в виде монослоя.
Описанный метод приготовления красителей и препаратов применяют в различных модификациях. Так, можно сохранять фиксированный материал в свежем фиксаторе при температуре
О—3°С, а окраску и мацерацию объектов вести в смеси растворов 2%-го ацетоорсеина и 1 и. НС1 в соотношении 9:1 при подогревании или воспользоваться 4%-м ацетолакмоидом и 1 н. НС1 (9:1) для мацерации и окраски с последующим перенесением объектов в ацетолакмоид. В некоторых случаях фиксированный материал сохраняют в 70%-ном растворе спирта при температуре 0—3°С и окрашивают в ацетокармине с добавлением железа.
Иногда материал мацерируют не в соляной кислоте, а в ацетокармине или ацетоорсеине, в которых его оставляют на ночь. В ацетолакмоиде материал можно держать двое суток, например корни гречихи.
