Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Паушева З.П. -> "Практикум по цитологии растений " -> 38

Практикум по цитологии растений - Паушева З.П.

Паушева З.П. Практикум по цитологии растений — М.: Агропромиздат, 1988. — 271 c.
ISBN 5-10-000614-5
Скачать (прямая ссылка): praktiumpocitologii1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 32 33 34 35 36 37 < 38 > 39 40 41 42 43 44 .. 110 >> Следующая

Раствор 2 представляет собой ацетатный буфер с pH 4,8. Для приготовления буфера в мерную колбу наливают 1,2 мл ледяной уксусной кислоты и доводят объем до 100 мл. Затем отдельно растворяют в 100 мл воды 2,72 г ацетата натрия. Смешивают 74 мл раствора уксусной кислоты со 100 мл раствора ацетата натрия. Получается буфер с pH 4,8.
Перед употреблением растворы 1 и 2 смешивают в равных объемах. Последовательность работы следующая.
1. Депарафинированные срезы доводят до воды.
2. Помещают срезы в буферный раствор красителей на 20 мин, а затем омывают водой.
3. Обезвоживают срезы в ацетоне и последовательно переносят их в две смеси ацетона с ксилолом (10% ацетона и 90% ксилола, 50% ацетона и 50% ксилола).
4. Помещают срезы в ксилол, затем заключают в бальзам.
На препаратах метиловый зеленый окрашивает ДНК в зеленый цвет, а пиронин окрашивает РНК в красный. При этом параллельные препараты перед окрашиванием обрабатывают нуклеазами, например 0,1%-м водным раствором рибонуклеазы в течение 2—3 ч при температуре 37°С. Вместо рибонуклеазы можно использовать 5—10%-й раствор трихлоруксусной кислоты. Необходимость обработки параллельных препаратов нуклеазами связана с тем, что эти красители не специфичны для нуклеиновых кислот и могут связываться другими веществами. Так, пектиновые вещества могут также окрашиваться пиронином.
Для изучения локализации нуклеиновых кислот применяют люминесцёнтный метод с использованием красителя акридина
оранжевого. Этот краситель при низких концентрациях и определенном pH связывается с ДНК с образованием мономеров» окрашенных в зеленый цвет, а с РНК — с образованием красных димерных катионов, что обусловливает различное свечение этих кислот в ультрафиолетовом свете.
Для изучения растительных объектов после их фиксации по Карнуа иногда применяют методику Берталанфи. При этом депарафинированные срезы быстро проводят через растворы спирта (80, 70, 50%-й), дистиллированную воду, 1%-й раствор уксусной кислоты и снова через дистиллированную воду, а затем окрашивают в 0,01 %-м растворе акридина оранжевого в течение 3 мин. Раствор акридина оранжевого вначале готовят в концентрации 0,1%, а перед употреблением разводят до 0,01% фосфатным буфером с pH 6. После окраски объект переносят на одну минуту в фосфатный буфер с pH 6 и дифференцируют в 0,1 М СаС12 1—2 мин, ополаскивают фосфатным буфером, накрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом Люмам в сине-фиолетовом свете. Ядра клеток светятся ярко-зеленым, а ядрышки — желтовато-красным светом.
Для выявления основных белков (гистонов) используют специфический краситель прочный зеленый (фастгрюн).
Объекты после фиксации в 10%-м растворе формалина в течение 3—6 ч промывают в проточной воде 10—12 ч, обезвоживают и по обычной методике парафинируют. Краситель готовят, растворяя 100 мг прочного зеленого в 10 мл воды, и доводят pH до 8. Перед окрашиванием срезы помещают в 5%-й раствор трихлоруксусной кислоты на 15 мин при 100°С для удаления нуклеиновых кислот, которые могут маскировать окраску на белки. Последовательность работы следующая.
1. Депарафинированные срезы доводят до воды (см. с. 86).
2. Обрабатывают срезы трихлоруксусной кислотой.
3. Промывают срезы в 70%-м растворе этилового спирта, а затем в воде.
4. Переносят срезы в краситель на 20 мин при 22°С.
5. Последовательно переносят срезы в воду, в 96%-й раствор спирта, карбол-ксилол, ксилол и заключают в бальзам.
На препаратах основные белки окрашиваются в изумруднозеленый цвет.
Для одновременного выявления белков и углеводов применяют свежеприготовленные проционовые красители. Работу выполняют в следующей последовательности.
1. Депарафинированные срезы доводят до воды (см. с. 86).
2. Окрашивают срезы 0,1 %-м раствором проционового ярко-голубого RS в фосфатном буфере при pH 5,6—6 и температуре 55—60 °С в течение часа.
3. Тщательно промывают срезы в дистиллированной воде.
4. Окрашивают срезы 0,1 %-м раствором проционового ярко-
красного 2BS в 1%-м растворе соды (pH 10,5) в течение 20 мин при комнатной температуре.
5. Срезы промывают водой, обезвоживают, переносят в ксилол и заключают в бальзам.
Монтирование препаратов
Предметные стекла со срезами вынимают из ксилола пинцетом, вытирают с нижней стороны и кладут на ровную поверхность, покрытую белой бумагой. Затем быстро, не допуская подсыхания срезов, капают сверху одну каплю канадского бальзама и каплю чистого ксилола. Берут чистое покровное стекло, ставят его наклонно на предметное, касаясь бальзама, и осторожно опускают. Справа и слева от покровного стекла кладут кусочки фильтровальной бумаги, для удаления излишков ксилола и бальзама. Затем препарат осторожно вытирают тряпочкой, смоченной в ксилоле, и сушат в течение нескольких дней. Иногда иа препараты сверху накладывают небольшие гирьки массой 5—10 г для удаления пузырьков из-под покровного стекла.
После сушки препарат окончательно протирают, просматривают под микроскопом и подписывают. На левой стороне его ставят очередной номер, который заносят в специальный каталог с указанием способа окраски и номера по журналу фиксации.
Предыдущая << 1 .. 32 33 34 35 36 37 < 38 > 39 40 41 42 43 44 .. 110 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed