Практикум по цитологии растений - Паушева З.П.
ISBN 5-10-000614-5
Скачать (прямая ссылка):
Последовательность работы следующая.
1. Помещают стекла со срезами в первый сосуд с ксилолом на 10—30 мин, затем во второй—на 5 мин.
2. Обмывают стекла со срезами 96%-м раствором спирта из капельницы и переносят их в сосуд с таким же раствором на 10—15 мин.
3. Промывают стекла со срезами в дистиллированной воде
3—5 мин.
4. Помещают стекла со срезами в 1%-й раствор генцианового фиолетово’го на 5 мин или дольше в зависимости от объекта.
5. Промывают стекла со срезами в дистиллированной воде в течение нескольких секунд.
6. Помещают стекла со срезами на 30 с в раствор: 1 г йода +
4- 1 г йодида калия в 100 мл 80%-го раствора спирта (вместо спирта можно брать воду).
7. Обмывают стекла со срезами 96%-м раствором спирта и помещают в сосуд с таким же раствором на 2—3 с.
8. Обмывают стекла со срезами 100%-м спиртом и помещают в сосуд с ним на несколько секунд, но можно задержать дольше, чтобы улучшить обезвоживание.
9. Дифференцировку проводят в гвоздичном масле, а при его отсутствии — в карбол-ксилоле. Для приготовления последнего 70—80 мл ксилола смешивают с 20—25 мл расплавленного фенола. Колбу с фенолом подогревают на водяной бане. Можно дифференцировать в смеси гвоздичного масла и ксилола (1:1).
10. Помещают стекла со срезами в третий сосуд с ксилолом , на несколько секунд, а затем в четвертый — на несколько минут.
11. Заключают срезы в канадский бальзам.
Окрашивание срезов ацетокармином по Фаворскому. В цитологической практике ацетокармин обычно применяют для окрашивания временных препаратов. Однако его можно использовать и для приготовления постоянных препаратов. Н. В. Фаворский предложил два способа окрашивания.
Первый способ. На предметные стекла со срезами, освобожденными от парафина в ксилоле и доведенными до дистиллированной воды, накапывают ацетокармин (приготовление ацето-кармина, см. с. 98). Срезы опрашивают несколько минут или стекла с ними подогревают на спиртовке до появления паров. Избыток ацетокармина сливают, стекла со срезами ополаски-
вают водой и дифференцируют в 0,5%-м растворе аммиака под микроскопом (выпускаемый промышленностью аммиак принимают за 100%-й). Затем их промывают в воде в течение 5 мин, обезвоживают в 96%-м растворе и 100%-м спирте, замещают спирт на ксилол и заключают срезы в канадский бальзам. Такие препараты по цвету сходны с препаратами, окрашенными по Фёльгену.
Второй способ. Срезы окрашивают в ацетокармине в течение 5 минут, промывают в воде, а затем переносят в 3—5%-й раствор железоаммонийных квасцов и нагревают до появления паров. Стекла со срезами хорошо промывают в воде, обезвоживают в спиртах, переносят в ксилол, а затем заключают срезы в канадский бальзам. Хромосомы приобретают черный цвет.
Окрашивание срезов по Модилевскому. Эмбриологические препараты можно хорошо окрасить, применяя следующую схему работы.
1. Депарафинированные, т. е. освобожденные от парафина
в ксилоле и промытые в спирте, срезы доводят до воды (см.
с. 86).
2. Окрашивают срезы 0,25%-м водным раствором фуксина основного в течение 3 мин. Иногда время окрашивания может длиться несколько часов.
3. Промытые в воде срезы дифференцируют в 96%-м растворе спирта, пока не станут резко видны включения в цитоплазме, хроматиновые элементы и ядрышки в ядре.
4. Обезвоживают срезы в абсолютном спирте.
5. На предметное стекло со срезами наносят анилин с рас-
творенным в нем красителем, например лихтгрюном, метиленовой синей, азуром 1 или азуром 2. Анилин (C6HsNH2) представляет собой бесцветную жидкость, малорастворимую в воде. Вместо него можно взять гвоздичное масло. Продолжительность окрашивания от 2 до 10 мин.
6. Дифференцируют срезы в смеси толуола или ксилола са спиртом (4:1).
7. Срезы помещают в толуол или ксилол, а затем заключают в бальзам.
Методика окрашивания хромосом у отдаленных гибридов по Элленгорну. Я. Е. Элленгорн (1947) изучал на микротомных препаратах мейоз у ржано-пырейного гибрида первого поколения Secale cerectleXAgropyron glaucum. Оказалось, что при определенных условиях окрашивания препаратов можно наблюдать различие в окраске хромосом родительских пар. Колосья А. Я. Элленгорн фиксировал по Карнуа. Депарафинированные препараты протравливал железоаммонийными квасцами и окрашивал гематоксилином Гейденгайна, смешанным с равным объемом буферного раствора с pH 5. После дифференцировки препаратов хромосомы ржи (<Secale се-
reale), которые вели себя как униваленты, оказались окрашенными в черный цвет, а хромосомы пырея сизого (Agropyron glaucum) —в серый.
Окрашивание срезов для выявления нуклеиновых кислот, белков и углеводов. Для выявления дезоксирибонуклеиновой кислоты в ядрах клеток применяют реакцию Фёльгена. Известно, что в состав ДНК входят остатки фосфорной кислоты, сахар (а-дезоксирибоза) и азотистые основания. Дезоксирибоза в ходе гидролиза с соляной кислотой превращается в альдегид, который при взаимодействии с фуксиносернистой кислотой (реактив Шиффа) окрашивается в красновато-фиолетовый цвет. Таким образом, реакция Фёльгена состоит из двух этапов: гидролиза и окрашивания. В качестве контроля используются препараты, не подвергавшиеся гидролизу. Их помещают в фуксииосернистую кислоту на 10—15 мин. Окрашивания не должно быть.
