Практикум по цитологии растений - Паушева З.П.
ISBN 5-10-000614-5
Скачать (прямая ссылка):
6. Тщательно промывают стекла в дистиллированной воде в течение 5—10 мин.
7. Помещают стекла со срезами в 0,1 — 1%-й раствор гематоксилина на 10—12 ч.
8. Промывают стекла со срезами сначала в водопроводной, а потом в дистиллированной воде по 10—15 мин.
9. Дифференцируют срезы в 2%-м растворе железоаммонийных квасцов, в котором они быстро теряют краситель и из черных становятся синими. Окончательную дифференцировку ведут под микроскопом после промывки в дистиллированной воде, чтобы установить момент почти полной потери красителя цитоплазмой. Ядра должны оставаться интенсивно окрашенными.
10. Промывают отдифференцированные срезы в проточной воде в течение 15 мин.
11. Обмывают стекла со срезами 96%-м раствором спирта из капельницы и помещают в сосуд с этим же раствором на 5—15 мин.
12. Обмывают стекла со срезами абсолютным спиртом из капельницы и помещают в сосуд с этим же спиртом на 10— 15 мин.
13. Помещают стекла со срезами в смесь 100%-го спирта и ксилола на 3—5 мин.
14. Обмывают стекла со срезами ксилолом из капельницы и помещают в третий сосуд с ксилолом на 15 мин, затем в четвертый — на, 5 мин.
15. Заключают срезы в канадский бальзам..
Для рассматриваемого способа окрашивания характерно протравливание срезов железоаммонийными квасцами. При последующем действии красителя образуется черный железогема-теиновый лак, который неодинаково удерживается различными структурами клетки. Окраска сохраняется многие годы. Цитоплазму, ядрышки и оболочку можно подкрашивать сразу после дифференцировки 1%-м раствором эозина.
Срезы, заключенные в бальзам, во время просмотра их под микроскопом выглядят иначе, чем в воде. Хромосомы имеют темно-синий цвет, цитоплазма и оболочки — бесцветные, если не было подкраски.
Существует ускоренный способ окрашивания срезов железным гематоксилином. В этом случае протравливание в квасцах и окрашивание в гематоксилине ведут в течение 30—40 мйц в термостате при температуре 45—56°С.
Окрашивание срезов гематоксилином по Дела ф и л ь д у. Этот способ чаще используют в работе с эмбриологическими препаратами. Хорошие результаты получаются только при правильном приготовлении красителя. К 100 мл насыщенного водного раствора алюмоаммонийных квасцов прибавляют по каплям раствор, состоящий из 1 г гематоксилина,
растворенного в 6 мл абсолютного спирта. Полученный раствор ставят на неделю на свет в колбе с неплотной пробкой для доступа воздуха. Затем в колбу добавляют по 25 мл глицерина н метилового спирта и не ранее чем через 4 ч раствор фильтруют.
Краситель готов к употреблению спустя 1—2 мес. Его можно долго хранить в темном месте. Перед употреблением краситель разводят в 3—4 раза дистиллированной водой.
Последовательность работы следующая.
1. Помещают предметные стекла со срезами в первый сосуд с ксилолом на 10—30 мин, а затем во второй — на 5 мин.
2. Обмывают стекла со срезами 96%-м раствором спирта из капельницы и помещают в сосуд с таким же спиртом на 5— 30 мин.
3. Промывают стекла со срезами в двух сменах дистиллированной воды в течение 3—5 мин.
4. Помещают стекла со срезами в гематоксилин Делафиль-да на 5—10 мин.
5. Промывают стекла со срезами в водопроводной, а потом в дистиллированной воде 5 мин. Если срезы перекрашены, их можно дифференцировать в спирте, подкисленном соляной кислотой.
6. Переносят стекла со срезами в 1%-й раствор эозина на
1—2 мин (1 г эозина растворяют в 100 мл 70%-го раствора спирта или в дистиллированной воде). Дифференцировку срезов проводят в 96%-м растворе спирта.
7. Обмывают стекла со срезами 96%-м раствором спирта и переносят в сосуд с таким же раствором. Продолжительность пребывания в спирте контролируют при помощи микроскопа,, так как в спирте идет дифференцировка срезов. Эозин должен подкрасить цитоплазму и ядрышки.
8. Обмывают 100%-м спиртом стекла со срезами и переносят сосуд с таким же спиртом на 1—3 мин.
9. Переносят стекла со срезами в смесь 100%-го спирта и ксилола на 1—3 мин.
10. Обмывают стекла со срезами ксилолом и переносят в третий сосуд с ксилолом на 5—10 мин, а затем в четвертый — на 5 мин.
11. Заключают срезы в канадский бальзам.
Срезы, окрашенные по Делафильду, имеют ядра и хромосомы синего цвета. Эозин подкрашивает цитоплазму и ядрышки
в,малиновый цвет. Окраска сохраняется многие годы,
^ Окрашивание срезов генциановым фиолето-?;врм по Ньютону. Метод применяют для окрашивания цитологических и эмбриологических препаратов. Он занимает мало времени. Хромосомы окрашиваются в фиолетовый цвет, оставаясь полупрозрачными, что облегчает подсчет длинных, нале-
гающих друг на друга хромосом. Окраска менее долговечна, чем при использовании предыдущих красителей.
Генциановый фиолетовый состоит из кристаллического фиолетового и примесей. Желательно брать чистый краситель, так как примеси окрашивают цитоплазму, что отрицательно сказывается на контрастности структур клетки. Для приготовления красителя растворяют 1 г генцианового фиолетового в 100 мл дистиллированной воды.
