Практикум по цитологии растений - Паушева З.П.
ISBN 5-10-000614-5
Скачать (прямая ссылка):
мутными. При переносе препаратов из одной жидкости в другую принято обмывать их из капельницы с обеих сторон. Например, после ксилола препарат обмывают 96%-м раствором спирта, а затем переносят в сосуд с таким же раствором. Обмывают препарат и перед переносом его в абсолютный спирт, чтобы не занести в него воду. Ни в коем случае нельзя допускать подсыхания срезов во время переноса препаратов из одной жидкости в другую.
Для каждого объекта выбирают свой метод окрашивания в зависимости от цели исследования и фиксатора. Различные структуры в клетке неодинаково воспринимают и удерживают красители. Все известные красители по своему происхождению делят на три группы: растительного происхождения, животного и синтетические. Последние, в свою очередь, делят на основныеЛ кислые и нейтральные. Для окраски ядер используют основные синтетические красители (геициановый фиолетовый), а также растительного (гематоксилин) и животного (кармин) происхождения. Растворы красителей могут быть спиртовыми и водными. В последние добавляют кристаллик антисептика — тимола.
Существующие методы окрашивания можно разделить на две группы. При первой —с прогрессивным окрашиванием — срезы помещают в слабый раствор красителя. Окрашивание длится несколько минут, пока необходимые структуры в клетке не будут четко видны на препарате. При второй — с регрессивным окрашиванием — срезы заведомо перекрашивают концентрированным раствором красителя. Избыток краски удаляют со срезов в специально подобранных растворах. Этот прием называют дифференцированием препаратов, в ходе которого краску следует оставить только на определенных структурах клетки. Контроль за дифференцированием ведут под микроскопом, используя объективы с небольшим увеличением.
Окрашивание срезов гематоксилином по Г е й-деигайну. Гематоксилин готовят из экстракта кампешевого дерева. Для окрашивания срезов используется продукт окисления гематоксилина — гематеин (Ci6Hi206). Существует два способа приготовления красителя.
Первый способ (ускоренный, часто используется в лабора-ториях), 1 г гематоксилина растворяют в 100 мл дистиллированной воды в колбе при кипячении на водяной бане в течение 30— 60 мин. После остывания раствор фильтруют четыре раза для окисления гематоксилина и добавляют кристаллик тимола. Необходимо сразу обратить внимание на цвет готового красителя. Он должен быть ярко-красным или красно-бурым. Желтоватый оттенок указывает на его невысокое качество, в результате чего трудно получить хорошую окраску срезов.
Приготовленный краситель разводят перед употреблением равным объемом дистиллированной воды.
Второй способ. 1 г гематоксилина растворяют в 10 мл 96%-го раствора этилового спирта, добавляют 90 мл дистиллированной воды, выдерживают на свету 3—4 недели, затем фильтруют и разводят перед употреблением.
Гематоксилин по Гейденгайну применяют для окрашивания цитологических и эмбриологических препаратов. При окраске хромосом хорошие результаты получают при использовании фиксатора Навашина. Этот же краситель применяют для окраски митохондрий.
Во время окрашивания срезов надо стремиться не загрязнить краситель. Окрасив небольшую партию препаратов, его нужно отфильтровать и вновь использовать. Перед употреблением хранившегося красителя сначала определяют его пригодность для работы. Для этого в стакан с водопроводной водой вливают несколько капель гематоксилина. Испорченный краситель дает желтую или грязно-лиловую окраску, нормальный — • а метисто-л иловую.
Необходимо заранее приготовить деревянные бруски с гнездами и цилиндрические сосуды с притертыми крышками. На сосуды наклеивают этикетки с указанием реактивов. Кроме того, готовят стаканы для воды, капельницы с абсолютным спиртом и 96%-м его раствором и ксилолом, чистые покровные стекла, пинцеты с широкими концами, нарезанную фильтровальную бумагу и марлевые салфетки, кюветы для дифференцирования, микроскоп, реактивы: метаксилол, абсолютный этиловый спирт и 96%-й его раствор, 0,5—1%-й раствор гематоксилина, 2%-й и 4%-й растворы железоаммонийных квасцов, канадский бальзам.
Во время работы следует соблюдать такую последовательность.
1. Помещают предметные стекла с наклеенными срезами в первый сосуд с ксилолом для удаления парафина. Длительность пребывания срезов в нем 10—30 мин, однако можно задержать препараты здесь и на более длительное время. Стекла ставят в сосуд с ксилолом парами, срезами наружу. Каждую пару стекол перекладывают фильтровальной бумагой или спичками.
2. Переносят стекла со срезами во второй сосуд со свежим ксилолом на 5 мин.
3. Обмывают каждое стекло 96% -м раствором спирта из капельницы и помещают в сосуд с этим же раствором. Длительность пребывания срезов в спирте 5 мин, иногда это время следует увеличить до 15—30 мин.
4. Промывают стекла со срезами в трех сменах дистиллированной воды по 5—10 мин. Стекла не должны иметь жирных следов и быть мутными.
5. Помещают стекла со срезами в 4%-й раствор железоаммонийных квасцов для протравливания на 4—6 ч.
