Практикум по цитологии растений - Паушева З.П.
ISBN 5-10-000614-5
Скачать (прямая ссылка):
Состав: изопропиловый спирт — 6 ч.; пропионовая кислота — 3 ч,; диоксан— 1 ч.; петролейиый эфир — 1 ч.; ацетон— 1 ч.
Ледяная уксусная кислота. Продолжительность обработки 12—72 ч в условиях холодильника. После фиксации промывают 96%-ным раствором этилового спирта.
Фиксатор В. Я- Бродского, или ФСУ (3:1: 0„3). Используют для цитохимических исследований, в нем хорошо сохраняется РНК.
Состав: формалин — 3 ч.; абсолютный спирт этиловый—1 ч.*4, уксусная кислота — 0,3 ч.
Продолжительность обработки корней 1—1,5 ч, максимум — 6 ч. После фиксации материал необходимо промыть водой в течение 12 ч или в трех-четырех сменах 70%-го раствора этилового спирта.
Фиксатор Н. Т. Кахидзе: 100 мл 75%-го раствора этилового спирта + 5 г сахарозы. Используется для изучения pH ИЭТ (изоэлектрическая точка).
Фиксатор Г. А. Левитского используют при изучении митохондрий. Он состоит из трех растворов, в которые последовательно помещают материал.
1-йраствор. Хромовая кислота, 1%-й раствор — 3 мл; формалин, 4%-й— 17 мл. Продолжительность фиксации—двое суток.
2-й раствор. Хромовая кислота, 1%-й раствор — 15 мл; осмиевая кислота, 2%-й-—2 мл; вода—18 мл. Продолжительность фиксации — 6 сут.
3-й раствор. Хромовая кислота, 1%-й раствор— 15 мл; осмиевая кислота, 2%-й— 4 мл. Продолжительность фиксации — 9 сут, затем материал промывают в течение суток в воде.
Фиксатор Рего также применяют для наблюдения хромосом.
Состав: диохромат калия, 3%-й раствор — 80 мл; формалин — 20 мл.
Зафиксированный материал выдерживают в темноте четверо суток, заменяя ежедневно фиксатор свежим. Затем на 8— 13 сут материал переносят в 3%-ный раствор дихромата калия, после чего в течение суток промывают в воде.
Смесь по Немецу используют для фиксации плазмо-десм.
Состав: пикриновая кислота (насыщенный раствор готовят на холоде) — 100 мл; ледяная уксусная кислота — 70,5 мл; концентрированная серная кислота — 0,5 мл.
Материал фиксируют 24 ч, а затем промывают 60%-м раствором этилового спирта. Окрашивают железным гематоксилином.
Формалиновый спирт также применяют для фиксации плазмодесм.
Состав: спирт этиловый, 70%-й — 50 ч.; формалин— 10 ч. Через сутки после фиксации материал промывают 70%-м раствором этилового спирта и хранят в '96%-м его растворе.
Смесь Гаммалунда обладает хорошими консервирующими свойствами для хлоропластов.
Состав: медный купорос (концентрированный раствор) — 15 ч.; формалин—1 ч.; вода — 5 ч. Материал выдерживают в растворе 1—2 недели, затем переносят в слабый раствор формалина (на 1 л воды 50 мл формалина).
Фиксация
При подготовке к фиксации и в процессе ее выполнения необходимо соблюдать некоторые общие правила:
подобранный фиксатор должен соответствовать цели исследования; инструменты подбирают заранее (рис. 26);
объем фиксирующей жидкости должен значительно (в 50— 100 раз) превышать объем материала;
фиксируют только свежие корни и бутоны, стараясь это делать на месте выращивания растений. Чтобы уберечь обнаженные корни от действия лучей солнца, лучше проводить фиксацию в тени;
крупные объекты, например корзинки сложноцветных, перед фиксацией разрезают на несколько частей, удаляя ненужные органы (листья, чашелистики, ости и т. д.), мешающие пропитыванию материала. Во время фиксации ножницами отрезают
копчики корней длиной 6—7 мм и сразу помещают в фиксирующую жидкость. Бутоны чаще фиксируют целиком, колосья предварительно разбирают на колоски, но иногда соцветия также фиксируют целиком;
время фиксации в течение суток определяют в каждом конкретном случае. Корни лучше фиксировать в те часы, когда наблюдается максимум митозов.
Правильная организация всей подготовительной работы предусматривает некоторую последовательность операций, обеспечивающую сравнимость изучаемых вариантов и сокращающую до минимума потери времени на непредусмотренные мероприятия.
Рассмотрим последовательность работы при фиксации корней.
1. Чтобы обеспечить нормальное деление клеток в корнях, вазоны с растениями накануне и за 1—2 ч до фиксации обильно поливают и ставят в теплое место с температурой воздуха 20— 25 °С. Чашки Петри с проросшими семенами держат в термостате при температуре 24—25°С. За 1—2 ч до фиксации их также поливают, чтобы корни были свежими.
2. Заранее готовят плоскодонные пробирки или флаконы из-под пенициллина с корковыми пробками и этикетки из плотной бумаги. Пробирки обычно используют с полезным объемом не менее 10 см3. При фиксации колосьев применяют плоскодонные пробирки большего объема, так чтобы в каждую из них можно было поместить несколько колосьев одного варианта.
Для этикеток берут белую плотную бумагу. Пергаментная бумага и калька для этих целей не подходят. Размер этикеток 1—1,3X3,5—4 см. На них обычным карандашом аккуратно пишут номер фиксации по журналу регистрации фиксаций, дату
и час обработки, название объекта (например, «корни Triticum durum»), сокращенное название фиксатора (Ф. К.— фиксатор Карнуа). Этикетка в пробирке должна соответствовать этикетке в вазоне, в поле или чашке Петри. Особенно важно отметить вариант исследования.
