Практикум по цитологии растений - Паушева З.П.
ISBN 5-10-000614-5
Скачать (прямая ссылка):
и риса берут 0,1 %-й раствор колхицина и выдерживают в нем соответственно 5 и 4 ч.
Другие зерновые культуры и картофель для приостановки митозов опускают в раствор колхицина 0,01 %-й концентрации. Молодые листочки можно выдерживать в 0,2%-м растворе колхицина в течение 1—2 ч.
Для обработки корней иногда используют насыщенный раствор парадихлорбензола. Для этого 5—10 г кристаллического препарата растворяют в 500 мл дистиллированной воды и оставляют в закрытой посуде в термостате при температуре 60 °С на 10—12 ч, Материал опускают в раствор на 2—3 ч при температуре 12—16 °С, корни гороха при комнатной температуре — на 6 ч.
Для кардиологического анализа нередко действие колхицина сочетают с последующей обработкой смесью насыщенного раствора парадихлорбензола и 0,002 М 8-оксихинолина (1:1). При исследовании пшеницы берут насыщенный раствор монобром-нафталина в воде и 0,1—0,01 %-й раствор колхицина, кукурузы— 0,05%-й — колхицина и 0,5%-й — монобромнафталина. Экспозиция в обоих случаях—4 ч (общее время).
Растворы колхицина, монобромнафталина и других веществ готовят в резиновых перчатках.
Хромосомы укорачиваются также, если перед фиксацией выдерживать чашки Петри с проросшими семенами в холодильнике при температуре 1—2°С в течение суток.
При изучении морфологии хромосом иногда объекты перед фиксацией обрабатывают одним из следующих способов:
в 2%-м растворе кумарина 2 ч при температуре 12—16 °С; в смеси кумарина и 8-оксихинолина (1:1) в течение 2 ч при 16 °С.
Фиксаторы, их состав и использование
Фиксация материала, т. е. быстрое умерщвление клеток в специально подобранных растворах ядовитых реактивов, которые называются фиксаторами, прерывает тот или иной процесс в клетке, вызывая необратимые изменения. При этом коллоиды протопласта переходят в нерастворимое состояние.
Известно много фиксаторов, но каждый из них имеет определенное назначение. Очень важно выбрать такой фиксатор, который, убивая клетку, несильно искажает ее прижизненную структуру и отвечает целям исследования. Для цитологических и эмбриологических исследований обычно используют ядерные фиксаторы (фиксатор С. Г. Навашина, Карнуа и др.), хорошо фиксирующие ядр’о. Некоторые реактивы хорошо фиксируют митохондрии и пластиды (фиксатор Г. А. Левитского) и др.
Обычно фиксатор представляет собой смесь нескольких реактивов, каждый из которых редко используется для фиксации вследствие одностороннего действия. В состав этих смесей могут входить: ледяная уксусная кислота, хромовая кислота, формалин, хлороформ, осмиевая кислота, спирт и др.
Уксусная кислота (СН3—СООН) — бесцветная жидкость с резким запахом. Хорошо смешивается с водой, спиртом,, эфиром, хлороформом. Ледяная уксусная кислота имеет 99,8% основного вещества и при охлаждении образует кристаллическую массу. Эта кислота, быстро проникая в ткани, может вызвать их набухание, хорошо осаждает нуклеиновые кислоты. Кроме того, она хорошо сохраняет форму хромосом, но разрушает митохондрии и комплекс Гольджи. Уксусная кислота входит в состав многих ядерных фиксаторов, но может использоваться и самостоятельно. В последние годы ее нередко заменяют при фиксации пропио новой кислотой (СНз—СН2— —СООН), которая способствует лучшей фиксации и окрашиванию объектов.
Хромовую кислоту готовят растворением в воде хромового ангидрида СгОз — сильного окислителя, представляющего собой темноокрашенные кристаллы, очень гигроскопичные и легкорастворимые в воде. Она проникает в объекты не очень быстро, коагулирует белки, сохраняет детали строения ядра, цитоплазмы, а также митохондрии и комплекс Гольджи. После фиксации хромовой кислотой объект необходимо тщательно промыть водой, иначе образуется осадок, мешающий окрашиванию тканей.
Осмиевая кислота представляет собой раствор сильного окислителя — тетраоксида осмия (0s04). Эта кислота медленно, а иногда и неравномерно проникает в объект. Однако она вызывает наименьшие изменения в структуре цитоплазмы и ядра. Ею можно фиксировать митохондрии, а из органических соединений— липоиды и жиры.
Формалин — водный раствор формальдегида (СН20), примерно 40%-й. Это вещество может образовывать осадки в тканях, так как содержит в виде примеси муравьиную кислоту. Чтобы избежать их появления, необходимо пользоваться нейтральным формалином. Для этого на дно темной бутылки с его концентрированным раствором насыпают мел. Иногда нераз-веденный формалин образует белый осадок, для растворения которого бутыль ставят в термостат при температуре 54—56 °С на сутки.
Формалин используют как составную часть ядерных фиксаторов. Он сохраняет тонкую структуру цитоплазмы, митохондрий и комплекса Гольджи, фиксирует липоиды, жирк и жирные кислоты, придавая некоторую твердость тканям. После фиксации необходима тщательная промывка в воде. Подмечено, что
после фиксации объектов формалином и хромовой кислотой они плохо окрашиваются кармином.
В качестве составных частей фиксаторов нередко используют различные растворители: ацетон (СН3—СОСНз), ди-оксан (С4Н802), хлороформ (СНСЦ), петролейный эфир и спирты— этиловый, или этанол, — С2Н5ОН, изопропиловый, или пропанол-2,—СН3—СН(ОН)—СНз и др. Из них наиболее часто употребляют этиловый спирт. Он осаждает нуклеиновые кислоты, альбумины, глобулины, но растворяет липоиды. Благодаря нейтральной реакции применим для гистохимических исследований. Один этанол редко используют как фиксатор, так как он вызывает искажение структур клетки, сильное сморщивание и затвердение тканей.
