Практикум по цитологии растений - Паушева З.П.
ISBN 5-10-000614-5
Скачать (прямая ссылка):
ПОСТОЯННЫЕ МИКРОТОМНЫЕ ПРЕПАРАТЫ
Исследование микротомных препаратов сыграло огромную роль в развитии цитологии и эмбриологии растений. Многие отечественные ученые, начиная с С. Г. Навашина, сделали очень ценные наблюдения на постоянных микротомных препаратах. Эти препараты являются прекрасным демонстрационным материалом и могут храниться долгие годы. На тонких срезах толщиной 110—22 мкм можно изучать митоз и мейоз, подсчитывать число хромосом, наблюдать проникновение пыльцевых трубок в зародышевый мешок, двойное оплодотворение, развитие зародыша, эндосперма и т. д.
Техника приготовления окрашенных микротомных препаратов для растений введена В. И. Беляевым. Объекты, предназна-
ченные для таких исследований, претерпевают сложную обработку. Ниже приведена последовательность обработки исследуемого материала по Юрцеву.
1. Подготовка материала к фиксации.
2. Фиксирование материала водным (24 ч) или спиртовым фиксатором (30 мин—12 ч).
3. Промывка фиксированного материала:
после водных фиксаторов после спиртовых фиксаторов
в проточной воде 1—3 ч в трех сосудах с 80%-м раствором этилового
спирта по 1—2 ч в каждом (запах уксусной кис-лоты должен исчезнуть)
4. Полное обезвоживание промытого материала:
при водных фиксаторах при спиртовых фиксаторах
в растворах этилового спирта: 0 растворах этилового спирта:
20%-и \ 96%-й )
40 /о-ll I п0 зо мин в 96%-й I __ , IT _
60%-й (каждом 100%-й ( каждом
80%-й (можно оставить надол- 100%-й
го) } '
96%-й
100%-й [по 1 ч в каждом
100%-й
5. Пропитывание материала растворителями парафина (хлороформом, ксилолом или бензолом):
3 ч. абсолютного этилового спирта -Ь 1 ч. хлороформа (или ксилола)
2 ч. абсолютного этилового спирта -Ь 2 ч. хлороформа (или ксилола) * по 1 ч
1 ч. абсолютного этилового спирта + 3 ч. хлороформа (или в каждом ксилола)
хлороформ 1 (или ксилол 1) хлороформ 2 (или ксилол 2)
6. Пропитывание материала парафином (замещение промежуточной жидкости парафином): в хлороформ (или ксилол) добавляют парафин и эту смесь помещают в термостат при температуре 56—57 °С до полного испарения хлороформа (или ксилола) и замещения его в материале парафином в течение 3— б сут.
7. Заливка материала в парафин (материал, залитый в парафин, можно хранить очень долго).
8. Изготовление блоков из материала, пропитанного парафином.
9. Получение срезов при помощи микротома.
10. Наклейка срезов на предметные стекла.
11. Просушивание препарата при 40—45°С (стекла со срезами можно хранить очень долго, если оберегать их от пыли и высокой температуры).
12. Удаление парафина, из срезов ксилолом.
13. Удаление ксилола из срезов спиртом.
14. Удаление спирта из срезов дистиллированной водой.
15. Окрашивание препаратов (иногда с предварительным протравливанием) и дифференцировка.
16. Обезвоживание окрашенных срезов 96%-м раствором и 100 %-м этиловым спиртом.
17. Замещение спирта в срезах на ксилол (одновременно происходит осветление срезов ксилолом).
18. Заключение срезов в канадский бальзам.
19. Просушивание препаратов и подчистка.
20. Этикетирование препаратов.
21. Изучение препаратов под микроскопом.
Подбор объектов для исследования и подготовка их к фиксации
Для цитологических и эмбриологических исследований очень важно определить, какие органы и ткани растения необходимы для работы. Например, митоз можно наблюдать в меристемах молодых быстрорастущих корней растений, в главных корнях проросших семян, в конусах нарастания стебля и др. Обычно для изучения митоза и подсчета числа хромосом в соматических тканях растения предпочитают работать с молодыми корнями, так как в них непосредственно под чехликом находится зона активного деления клеток (конус нарастания корня) и фигуры деления здесь удобно ориентированы.
Для изучения мейоза и подсчета числа хромосом во время деления материнских клеток микроспор используют у растений семейства мятликовые— молодые колосья за несколько дней до выколашивания, мотыльковые и некоторые другие — небольшие бутоны до приобретения ими окраски или непосредственно молодые пыльники. Оплодотворение и различные этапы эмбриогенеза наблюдают в опыленных цветках через определенные промежутки времени после нанесения пыльцы на рыльце.
Имея необходимые объекты для исследования, нужно обратить серьезное внимание на их подготовку к фиксации. От этого во многом зависит достоверность эксперимента. Например, чтобы наблюдать деление клеток в кончиках молодых корней» очень важно обеспечить соответствующую температуру воздуха, влажность среды, а в полевых условиях — еще почвенное питание и освещение, т. е. создать оптимальные условия для нормального роста и развития растений. Отсутствие необходимых условий тормозит рост растений и деление клеток.
